量子點熒光探針在生物醫學領域的研究進展

于 冰，肖國花，叢海林，王宗花，劉小冕

(1.青島大學化學化工與環境工程學院，山東 青島 266071；2.青島大學 纖維新材料與現代紡織國家重點實驗室培育基地，山東 青島 266071)

半導體量子點(Quantum dots，QDs)指的是尺度在幾埃與幾十埃之間的半導體納米晶體[1]。量子點是一類不同于本體又異于分子、原子特性的新型材料[2]，具有量子效率和消光系數高、激發光譜寬、發射光譜窄、發射光的顏色隨粒徑變化、光化學穩定性好等特點[3]。早期半導體量子點的應用研究主要集中在微電子和光電子領域，直到20世紀90年代 ，隨著半導體量子點合成技術的進步，其作為熒光探針應用于生物醫學領域的前景逐漸展現出來[4]。1998年，量子點作為生物探針的生物相容性問題得以解決，其在生命科學的應用迅速發展。目前，用于生物探針的量子點主要由第二副族和第六主族的元素組成，如硒化鎘(CdSe)、硫化鋅(ZnS)、碲化鎘(CdTe)、硫化鎘(CdS)等[5]。在生物醫學領域，對生命現象的觀察和研究已深入到單細胞、單分子水平，量子點因在光學特性、表面修飾和生物功能化等方面具有的優勢而在這些研究中得到了廣泛應用[6]。

1 量子點的制備方法

量子點的光譜性質與其晶體結構及單分散性密切相關，因此，制備方法和工藝是決定其熒光性能的關鍵因素。量子點的化學制備方法按溶劑的不同分為以下兩種：在有機相中合成和在水相中合成。

1.1 在有機相中合成

在有機溶劑中合成的量子點是基于有機物與無機金屬化合物或有機金屬化合物之間的反應而形成的，其光化學穩定性強、熒光效率高、合成方法成熟[7]。

Stodilka等[8]在甲苯中合成CdSe量子點，然后再用ZnS進行包裹，得到CdSe/ZnS核殼結構的量子點。Murray等[9]利用高溫反應在有機相中合成出具有較強熒光性能的CdSe量子點，以二甲基鎘(CdMe2)和三辛基硒化膦(SeTOP)作為反應前體、三辛基氧化膦(TOPO)作為配位溶劑，將前體的混合溶液快速注入劇烈攪拌的高溫TOPO中，待CdSe晶核形成后降溫，使其不再成核，再升溫使之緩慢生長，進而通過控制反應時間來控制量子點的大小。楊衛海等[10]以液體石蠟為高溫反應溶劑、油酸和油胺為混合穩定劑，采用高溫熱解法一步合成了高質量的CdSe量子點。王香等[11]以Se和ZnO粉末為原料，在十六胺(HDA)、月桂酸(LA)和三辛基膦(TOP)有機溶劑體系中合成了膠體硒化鋅(ZnSe)和ZnS量子點，合成的量子點分散性好、純度高。

然而，在有機相中合成的方法所選用的溶劑毒性大，合成條件苛刻，而且合成的量子點沒有水溶性，難以直接應用于生物體系[12]。

1.2 在水相中合成

水溶性是量子點應用于生物體系的關鍵因素。在水溶液中合成量子點，不僅解決了量子點的水溶性和生物相容性問題，而且原料成本低、合成方法簡單、重復性高、綠色環保、量子點表面電荷和表面性質可控、可直接用于生物標記，因而成為當前研究的熱點[13]。

萬異等[14]在水相中以巰基丙酸(MPA)作為穩定劑，合成出具有不同熒光發射波長的CdTe量子點，并考察了反應條件對CdTe量子點熒光性能的影響。楊旭等[15]以檸檬酸(CA)和MPA為穩定劑，采用低溫水熱技術合成了單分散的鈷離子摻雜的ZnS量子點。趙旭升等[16]采用一步合成法在水相中合成了PbS量子點，所合成的量子點單分散，粒徑為3～5 nm，熒光量子效率高達11.8%。Xia等[17]以MPA作為配體，在水相中合成了CdTe/CdSe核殼結構的量子點，該量子點對某些金屬離子如銅離子等顯示了很高的靈敏度。王超等[18]以MPA為穩定劑在水相中合成了銅摻雜的ZnSe量子點，不僅克服了有機相合成量子點的生物相容性的問題，且避免了鎘等重金屬元素的使用。

2 量子點的表面修飾

最初使用的量子點發光效率較低、易光化學降解和聚集，有機方法制備的量子點材料毒性大、生物相容性差、難以與生物細胞偶聯[19]，因此有必要對量子點表面進行修飾來提高它的光學特性及與生物大分子連接的能力。目前采用的表面修飾方法主要包括巰基化合物修飾、硅烷化修飾和聚合物修飾等。

Chan等[20]首次提出用巰基乙酸(TGA)修飾量子點，成功地解決了量子點與生物分子偶聯問題。宋冰等[21]用十八胺(ODA)對CdS量子點表面進行修飾，起到了鈍化表面的作用，減弱了CdS表面缺陷造成的電子空穴復合，從而減小了CdS量子點通過表面態發生輻射躍遷的幾率，有效地減弱了表面態發光。研究者還通過核殼結構對量子點進行表面修飾，在提高量子點穩定性和生物相容性方面取得了良好效果。曾慶輝等[22]采用連續離子層吸附技術合成了水溶性的CdTe/CdS核殼量子點，這種核殼結構量子點具有更好的化學和光學性質穩定性、更高的量子效率，且易于生物標記。Hu等[23]先在CdSe/ZnS量子點表面包裹一層親水的二氧化硅(SiO2)，然后用疏水的十八硅烷包裹，再與雙親性的聚乙烯-聚乙二醇分子進行組裝，形成了多重功能化核殼結構(圖1)，大大提高了所合成量子點的生物相容性。

圖1 有機聚合物和無機SiO2包裹的多重核殼結構功能化量子點的形成過程[23]

3 量子點熒光探針在生物醫學領域的應用

量子點應用最廣泛的領域是作為熒光探針對生物體系進行研究，已用于腫瘤的檢測和診斷、DNA分子的檢測、蛋白質的測定等方面。

3.1 腫瘤的檢測和診斷

通過制備能與特殊分子結構和基團結合的量子點，或將量子點與特異性的抗體鍵合，然后注入人體內，利用其專一性的結合和熒光特性，可以作為一種高效、穩定的新型熒光標記物應用于腫瘤的檢測與診斷。

Wu等[24]用巰基乙胺修飾的CdSe量子點對人肝癌細胞進行檢測，通過觀察其熒光圖像及利用實時細胞電子傳感系統對其追蹤，發現CdSe很容易與細胞質膜結合進入癌細胞，并使癌細胞的新陳代謝速度明顯減慢，為癌細胞的檢測與治療提供了新的方法。付志英等[25]用經羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)和聚乙二醇修飾的功能化的CdTe量子點熒光探針對胃癌細胞相關抗原進行了檢測，與傳統方法相比，不僅光穩定性得到很大提高，靈敏度也有所提高。Shi等[26]用縮氨酸修飾的CdSe/ZnS量子點對乳腺癌細胞進行檢測，量子點可以和癌變細胞快速結合，檢測時間大大縮短，且靈敏度較高。黃宇華等[27]用ZnS量子點熒光探針對裸鼠舌鱗癌移植癌組織切片中bcl-2蛋白進行分析，檢測結果定位準確、特異性強，為舌鱗癌的檢測提供了新的依據。陳軍等[28]研究CdTe量子點的濃度對口腔鱗癌細胞活性的影響發現，量子點濃度在20 nmol·L-1時，在幾小時至1～2 d內，口腔鱗癌細胞的生長都沒有受到影響，甚至在較高濃度下的數小時內，活性也沒有發生明顯的變化，因此CdTe量子點可以用于對口腔鱗癌活細胞的觀察。Hu等[29]發現水相合成的CdTe/CdS量子點與IgG結合可以有效地提高對癌胚抗原(CEA)檢測的靈敏度，與熒光素Cy3(環磷酰胺)標記的IgG相比，量子點使熒光強度大大增強(圖2)。

(a)波長365 nm紫外光激發 (b)波長546 nm可見光激發1～7：25 nmol·L-1、2.5 nmol·L-1、250 pmol·L-1 、25 pmol·L-1、2.5 pmol·L-1、250 fmol·L-1、25 fmol·L-1

3.2 DNA分子的檢測

目前多采用熒光探針法進行DNA分子的檢測。熒光探針法與傳統的同位素法相比，具有檢測快速、重復性好、用樣量少、無輻射等特點。

Han等[30]巧妙地將不同數量、不同熒光特征的量子點組合進內部鏤空的高分子小球中，從而形成具有不同光譜特征和亮度特征的微球。這種量子點熒光微球標記物的發射熒光能力和穩定性都很強，可以編成密碼標記不同的探針。根據微球上量子點的種類和它們之間熒光強度的比例，可以確定特異的DNA序列，同時獲得固定探針DNA和游離探針DNA的熒光信息。Patolsky等[31]通過熒光共振能量轉移研究了在CdSe/ZnS量子點表面進行調節聚合反應以及DNA復制的動力學過程。Dubertret等[32]利用膠束包覆的ZnO量子點與特定的DNA序列連接，通過熒光實驗對比，可以方便地識別與其互補的DNA序列。

3.3 蛋白質的測定

量子點與生物體或生物大分子通過特殊的相互作用鏈接，作為熒光探針標記細胞內的不同部位或組分，可同時觀測到不同顏色的熒光，并可基于熒光共振能量轉移原理進行蛋白質非特異性檢測和定量分析[33，34]。

蛋白質對量子點熒光探針有熒光增強或猝滅作用，如邱婷等[35]研究了用TGA修飾的水溶性量子點CdSe/ZnS與不同蛋白質的非特異性相互作用，發現牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、血紅蛋白和免疫球蛋白均能增強量子點的熒光，而細胞色素C卻使量子點的熒光猝滅，同時探討了量子點與蛋白質相互作用導致熒光強度變化的原因。馬金杰等[36]研究了不同巰基試劑修飾的CdTe量子點與BSA的相互作用，認為用巰基乙酸、L-半胱氨酸、還原型谷胱甘肽三種巰基化合物修飾劑包覆的CdTe量子點與BSA的非特異性相互作用均為靜態猝滅過程。Liu等[37]用經二巰基丁二酸(DMSA)修飾過的CdTe量子點檢測人免疫球蛋白(IgG)，檢出限低至0.05 ng·mL-1。許國峰等[38]通過制備鏈霉親和素修飾的CdTe量子點探針，建立了基于量子點探針的增強顯色可視化檢測方法，并結合蛋白質芯片分析技術，為反相蛋白芯片的制備提供了新的方法。

3.4 其它方面

量子點熒光探針還可用于生物體內藥物的檢測。

凌霞等[39]研究了CdTe量子點與廣譜抗菌藥物帕珠沙星的相互作用。結果表明，隨著帕珠沙星濃度的增大，CdTe量子點的熒光強度線性降低，可對體內藥物的剩余量進行測定。曹鳳歧等[40]基于CdS納米粒子的熒光強度增幅與諾氟沙星濃度成正比的作用機理，測定諾氟沙星的檢出限為1.5×10-3μg·mL-1。Chert等[41]采用量子點熒光探針法成功地將量子點標記的抗體用于殺蟲劑毒死蜱的定量檢測，大大提高了檢測的靈敏度。支援等[42]采用免疫磁珠磁性分離、免疫量子點熒光標記聯合應用的檢測方法，快速分析了乳品中阪崎腸桿菌的含量，有望應用于醫療衛生、食品安全等檢測領域。

4 結語

量子點熒光探針以其優良的光學特性在生物醫學、分析化學等主要學科領域顯現出獨特的優勢。雖然大多數量子點熒光探針還處在實驗室研究階段，距離實際應用尚有距離，其在降低或避免產生的毒性、增強生物相容性、提高產率和穩定性等方面還有待深入研究，但人們有理由相信，隨著量子點熒光探針制備技術與表面修飾技術的不斷完善和發展，量子點在生物醫學領域的發展必將突飛猛進。

[1] 黃玉剛，朱祖釗，李光吉，等.Ⅱ-Ⅵ族半導體量子點及其聚合物納米復合材料的制備[J].合成材料老化與應用，2008，37(3)：32-37.

[2] 徐萬幫，汪勇先，許榮輝，等.Ⅱ-Ⅵ型量子點的制備、修飾及其生物應用[J].無機材料學報，2006，21(5)：1031-1037.

[3] 歐紅葉.生物熒光標記物的新型材料——過渡金屬離子摻雜的ZnS、ZnSe量子點[J].重慶師范大學學報，2010，29(2)：75-79.

[4] 余啟鈺，劉春艷.用于生物標記的半導體量子點研究[J].感光科學與光化學，2006，24(5)：382-390.

[5] 楊冬芝，徐淑坤，陳啟凡.量子點的熒光特性在生物探針方面的應用[J].光譜學與光譜分析，2007，27(9)：1807-1810.

[6] 蔣飛榮，賈文婷，張興燊，等.熒光量子點探針及其標記技術[J].生命科學，2010，22(4)：391-395.

[7] Hyun B R, Bartnik A C, Lee J K, et al.Role of solvent dielectric properties on charge transfer from PbS nanocrystals to molecules[J].Nano Letters，2010，10(1)：318-323.

[8] Stodilka R Z，Carson J J L，Yu K.Optical degradation of CdSe/ZnS quantum dots upon gamma-ray irradiation[J].Journal of Physical Chemistry，2009，113(6)：2580-2585.

[9] Murray C B，Norris D J，Bawendi M G.Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E=sulfur，selenium，tellurium) semiconductor nanocrystallites[J].Journal of the American Chemical Society，1993，115(19)：8706-8715.

[10] 楊衛海，嚴守雷，衛晨，等.油胺/油酸穩定的CdSe量子點的綠色合成[J].分析測試學報，2010，29(1)：1-5.

[11] 王香，馬旭梁，封雪，等.ZnSe、ZnS量子點的可控合成與表征[J].發光學報，2009，30(6)：818-823.

[12] 楊芳芳，于俊生，謝穎.水溶性的CdSe/CdS/ZnS量子點的合成及表征[J].無機化學學報，2008，24(7)：1142-1147.

[13] 李軍，袁航，趙奎，等.CdTe納米晶與蛋白相互作用研究[J].高等學校化學學報，2003，24(7)：1293-1295.

[14] 萬異，章碧，陳奇丹，等.水相合成CdTe量子點標記親和素前后光譜變化的研究[J].分析儀器，2004，(3)：41-44.

[15] 楊旭，周宏，沈彬，等.ZnS：Co半導體量子點的制備及其光電化學性質[J].物理化學學報，2010，66(1)：244-248.

[16] 趙旭升，干建群，劉光華，等.PbS量子點的一步合成法及其光學性能[J].化學學報，2008，66(16)：1869-1872.

[17] Koshman Y E, Waters S B, Walker L A, et al.Delivery and visualization of proteins conjugated to quantum dots in cardiac myocytes[J].J Mol Cell Cardiol,2008，45(6)：853-856.

[18] 王超，高雪，蘇星光.水相合成Cu摻雜的ZnSe量子點[J].分析化學，2009，37(z1)：33-34.

[19] 王麗鳳，王麗萍，陳潔，等.QDs標記免疫調節肽及其與T細胞作用的表征[J].高等學校化學學報，2006，27(2)：271-273.

[20] Chan W C W，Nile S M.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science，1998，281(5385)：2016-2018.

[21] 宋冰，程軻，武超，等.CdS量子點的制備和光學性質[J].材料研究學報，2009，23(1)：152-156.

[22] 曾慶輝，張友林，安利民，等.CdTe/CdS量子點的Ⅰ-Ⅱ型結構轉變與熒光性質[J].高等學校化學學報，2009，30(6)：1158-1161.

[23] Hu X，Gao X.Silica-polymer dual layer-encapsulated quantum dots with remarkable stability[J].ACS Nano，2010，4(10)：6080-6086.

[24] Wu C，Shi L，Li Q，et al.Probing the dynamic effect of Cys-CdTe quantum dots toward cancer cellsinvitro[J].Chemical Research in Toxicology，2010，23(1)：82-88.

[25] 付志英，李朝輝，何曉曉，等.水溶性量子點熒光探針用于胃癌細胞相關抗原CA242的檢測[J].分析化學，2006，34(12)：1669-1673.

[26] Shi L，Paoli V D，Rosenzweig N，et al.Synthesis and application of quantum dots FRET-based protease sensors[J].Journal of the American Chemical Society，2006，128(32)：10378-10379.

[27] 黃宇華，趙建江，王治平，等.應用量子點熒光探針檢測裸鼠舌癌組織中bcl-2表達[J].廣東牙病防治，2010，18(6)：301-303.

[28] 陳軍，趙建江，王治平，等.量子點對口腔鱗癌細胞活性的影響[J].廣東醫學，2010，31(20)：2613-2615.

[29] Hu M，Yan J，He Y.Ultrasensitive，multiplexed detection of cancer biomarkers directly in serum by using a quantum dot-based microfluidic protein chip[J].ACS Nano，2010，4(1)：488-494.

[30] Han M Y，Gao X H，Su J Z，et al.Quantum dot tagged mi-crobeads for multiplexed optical coding of biomolecules[J].Nat Biotechnol，2001，19(7)：631-635.

[31] Patolsky F，Gill R，Weizmann Y，et al.Lighting-up the dynamics of telomerization and DNA replication by CdSe-ZnS quantum dots[J].Journal of the American Chemical Society，2003，125(46)：13918-13919.

[32] Dubertret B，Skourides P，Norris D J，et al.Invivoimaging of quantum dots encapsulated in phospholipid micelles[J].Science，2002，298(5599)：1759-1762.

[33] Kim Y P，Oh Y H，Oh E，et al.CdSe/ZnS quantum dots-g-quadruplex/heminhybrids as optical DNA sensors and aptasensors[J].Analytical Chemistry，2008，80(12)：4634-4638.

[34] Yu G，Liang J.Synthesis and application of quantum dots FRET-based protease sensors[J].Chemist & Biology，2006，13(7)：723-731.

[35] 邱婷，彭洪亮，何治柯.水溶性量子點CdSe/ZnS與蛋白質非特異性相互作用研究[J].化學傳感器，2007，27(2)：26-30.

[36] 馬金杰，梁建功，韓鶴友.不同巰基試劑修飾的CdTe量子點與BSA相互作用研究[J].光譜學與光譜分析，2010，30(4)：1039-1043.

[37] Liu X，Zhang Y，Lei J，et al.Quantum dots based electrochemiluminescent immunosensor by coupling enzymatic amplification with self-produced coreactant from oxygen reduction[J].Analytical Chemistry，2010，82(17)：7351-7356.

[38] 許國峰，李慧，張翠，等.量子點銀增強可視化檢測方法的研究與應用[J].分析化學，2010，38(10)：1383-1387.

[39] 凌霞，鄧大偉，鐘文英，等.水溶性量子點熒光探針用于帕珠沙星的含量測定[J].光譜學與光譜分析，2008，28(6)：1317-1321.

[40] 曹鳳歧，李丹，嚴拯宇.功能性硫化鎘納米粒子熒光增敏法測定諾氟沙星[J].光譜學與光譜分析，2009，29(8)：2222-2226.

[41] Chert Y P，Ning B A，Liu N，et al.A rapid and sensitive fluoro-immunoassay based on quantum dot for the detection of chlorpyrifos residue in drinking water[J].Journal of Environmental Science and Health，Part B，2010，45(6)：508-515.

[42] 支援，孟瑾，鄭小平，等.一種快速檢測阪崎腸桿菌的新方法——免疫磁性分離熒光標記[J].乳業科學與技術，2010，33(5)：231-234.