拷貝數對畢赤酵母重組菌表達豬胰島素前體的影響

陳 麗，郭美錦，儲 炬，莊英萍，張嗣良

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室 國家生化工程技術研究中心，上海 200237)

胰島素是體內調節能量代謝和糖代謝的重要激素，是治療糖尿病的特效藥物之一，重組胰島素已占領了大部分市場份額[1]。甲醇營養型畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種優秀的外源蛋白表達系統，具有乙醇氧化酶基因啟動子(PAOX)強、外源蛋白表達量高、分離容易、外源基因穩定性高、培養基要求低等特點[2]，其高密度發酵工藝日臻成熟。目前，大約有500多種外源蛋白成功地在該系統中得到表達[3]。鑒于酵母直接表達人胰島素原比較困難，作者采用表達豬胰島素前體(Porcine insulin precursor，PIP)，再通過純化和體外轉肽反應，以轉化為醫用人胰島素[4]。

基因劑量(Gene dosage)是重組畢赤酵母表達外源目的蛋白水平高低的重要影響因素之一。根據不同的外源蛋白特性，基因劑量對外源蛋白表達水平既有正的量效關系，也有負的量效關系，且各自影響機理不盡相同[5]。目前用畢赤酵母表達PIP的報道較多停留在菌株的構建和過程控制優化等方面[6，7]，而基因劑量方面的研究至今缺乏系統性報道。為此，作者以PIP基因拷貝數分別為1、6、12和18的G1、G6、A2和A3畢赤酵母重組菌為研究對象，通過5 L發酵罐進行補料分批培養，考察PIP基因拷貝數對畢赤酵母重組菌PIP蛋白表達、生理代謝參數、細胞存活率和基因穩定性等的影響。

1 實驗

1.1 菌株、培養基和種子制備

畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株，Mut+，載體pAO815、pPIC3.5K，蛋白引導序列來自釀酒酵母的α-雜交因子(α-Mating factor，α-MF)，外源基因為根據畢赤酵母偏愛密碼子人工合成的PIP基因，將含目的基因1、6、12和18拷貝的菌株，分別命名為G1、G6、A2和A3，自行構建[8]。

培養基和種子制備按文獻[9]方法進行。

1.2 5 L發酵罐發酵方法

從YPD平板上挑單克隆接種至種子搖瓶培養基中，于30℃、220 r·min-1培養20～24 h，直至OD600達到20左右；按接種量10%接種到裝有2 L分批培養基的5 L發酵罐(華東理工大學國家生化工程技術研究中心研制)中培養(用氨水調節pH值為5.0)；分批培養至甘油耗盡(20 h左右)，此時溶氧值與pH值上升，開始以限制性的速度補加含12 mL·L-1PTM1的50%(質量濃度，下同)甘油以提高菌濃，當OD600達到120左右，停止補加甘油，饑餓工程菌30 min左右，一次性加入2.5 g·L-1甲醇以使菌體適應甲醇環境，大約2 h左右溶氧值先下降后上升，正式進入誘導階段，開始流加含12 mL·L-1PTM1的100%甲醇，誘導72 h。在誘導過程中通過測定甲醇濃度和溶氧值變化來控制補料速率。

1.3 外源基因拷貝數的測定

酵母總DNA制備采用Bustn′Grab法[10]，外源基因定量參照文獻[11]。

1.4 目的蛋白PIP濃度的測定

采用外標法進行PIP的定量分析。使用Agilent 1100 HPLC系統，色譜柱為ES industries 公司MacroSep C8，5 μm 300 ?(15 cm×4.60 mm)；流動相：溶液A為20%乙腈-0.1%三氟乙酸；溶液B為90%乙腈-0.1%三氟乙酸；洗脫條件：溶液A 在14 min 內由100%降至70%，溶液B在14 min 內由0%升至30%；流速為1 mL·min-1；柱溫為40℃；檢測波長為214 nm。

1.5 甲醇濃度的測定

采用GC920型氣相色譜儀(上海海欣色譜儀器有限公司)分析發酵液上清中甲醇濃度。填料為Chromosorb 101型，色譜柱長1 m、內徑2 mm，載氣為氮氣，流量為15 mL·min-1，空氣和H2的流量分別為300 mL·min-1和30 mL·min-1(10∶1)，色譜柱溫度為100℃，汽化室和氫火焰溫度為200℃。

1.6 細胞活性分析

采用流式細胞儀[12，13]進行細胞活性分析。

1.7 尾氣分析

采用Extrel過程質譜MAX300-LG(USA)對發酵過程中的進氣和尾氣進行實時在線采集分析，發酵液單位體積氧代謝速率(Oxygen uptake rate，OUR，mmol·L-1·h-1)和單位體積CO2釋放速率(CO2Evolution rate，CER，mmol·L-1·h-1)參照文獻[14]計算。

2 結果與討論

2.1 不同拷貝數畢赤酵母重組菌生長比較(圖1)

圖1 不同拷貝數畢赤酵母流加培養的細胞光密度變化曲線

由圖1可知，隨著培養時間的延長，不同拷貝數菌株的細胞光密度(OD600)呈不同的變化特征，大致可分為三個階段：在甘油階段(0～28 h)，不同拷貝數菌株細胞生長無明顯差別，且生長均較快，OD600可同時達到140左右；在甲醇誘導初期(誘導0～24 h)，不同拷貝數菌株細胞生長雖然比其在甘油階段生長緩慢，但相互之間也沒有明顯的差異，在誘導24 h后OD600均可達到190左右，這主要是因為不同拷貝數的菌株誘導初期都需要經過一段時間的甲醇誘導PAOX1啟動和醇氧化酶(AOX1)的表達，從而使細胞利用甲醇生長[15]；在甲醇誘導24～72 h時，低拷貝數外源基因重組菌(1拷貝和6拷貝)的生長趨勢基本相似，最大OD600能達到360，但是高拷貝數外源基因重組菌(12拷貝和18拷貝)生長緩慢，最大OD600僅為270，明顯低于低拷貝數菌株。由此可見，拷貝數對甘油階段和甲醇誘導初期菌株生長無明顯影響，但甲醇誘導24 h后高拷貝數菌株(12拷貝和18拷貝)生長受到抑制，菌濃明顯低于低拷貝數菌株(1拷貝和6拷貝)，存在高拷貝數菌株在甲醇誘導后期生長緩慢現象。

2.2 不同拷貝數畢赤酵母重組菌PIP蛋白表達比較(圖2)

圖2 不同拷貝數畢赤酵母細胞PIP表達變化曲線

由圖2可見，經過72 h甲醇誘導培養，12拷貝畢赤酵母重組菌株PIP蛋白表達水平明顯高于其它拷貝數菌株的表達水平，各拷貝數菌株PIP最大表達量呈現“鐘罩型”變化趨勢：從1拷貝的110.105 mg·L-1增加到6拷貝的631.263 mg·L-1再增加到12拷貝的702.000 mg·L-1，隨后18拷貝菌株表達水平下降到514.526 mg·L-1。因此，12拷貝畢赤酵母菌株PIP蛋白表達量分別是1拷貝、6拷貝和18拷貝畢赤酵母菌株的6.376倍、1.112倍和1.360倍。

單位細胞光密度的PIP表達量(PIP/OD600)見圖3。

圖3 不同拷貝數畢赤酵母細胞PIP/OD600變化曲線

由圖3可知，PIP/OD600與PIP蛋白表達具有相同的趨勢，即隨著拷貝數的增加，PIP/OD600先增加后減小，12拷貝菌株的PIP/OD600最大，但不同的是18拷貝菌株的PIP/OD600要大于6拷貝菌株的PIP/OD600。這可能是由于兩者的細胞生物量不同引起的。

2.3 不同拷貝數重組畢赤酵母單位體積氧代謝速率與單位體積CO2釋放速率比較(圖4)

圖4 不同拷貝數畢赤酵母細胞OUR、CER和RQ的變化曲線

由圖4可知，不同拷貝數的畢赤酵母細胞接種經過短暫的延遲期后進入對數生長期。(1)在批培養階段，發酵過程在線參數單位體積氧代謝速率(OUR)和單位體積CO2釋放速率(CER)呈指數同步增長；而由于初始細胞光密度基數低，其代謝以細胞維持為主，隨著細胞光密度的增加，維持能增大，不同拷貝數畢赤酵母細胞呼吸商(Respiratory quotient，RQ=CER/OUR)的值均達到最大值0.75左右，直到22 h，OUR和CER陡降，表明甘油已經耗盡；(2)在甘油補料階段(22～28 h)，不同拷貝數畢赤酵母細胞的OUR、CER同時開始上升，RQ值雖然比批培養階段低，但是在此階段卻基本保持不變，均維持在0.64左右。由于RQ是表征細胞代謝的生理狀態參數，RQ值恒定說明在補甘油階段采用限制性流加策略，能較好地維持細胞的生理狀態、控制菌體的生長狀態，可提高底物甘油的細胞轉化率，從而有利于減少副產物的形成。發酵28 h后細胞達到一定密度(OD600約為150)，停止補加甘油，此時OUR、CER均急劇下降，說明甘油已不足或代謝完全。(3)在甲醇誘導階段，OUR和CER又同時開始上升，但是出現了增長的“分叉”現象，即上升幅度的非同步性，OUR的上升幅度較CER更大，具體體現在此時RQ出現了明顯的下降趨勢，但是整個蛋白表達階段RQ一直維持在0.54左右的水平，比細胞甘油生長階段的RQ明顯要小，這是因為畢赤酵母代謝甲醇有5條途徑，比甘油代謝增加了甲醇完全氧化(RQMax=0.68)和二羥丙酮合成(RQMax=0.67)2條途徑。

不同拷貝數重組畢赤酵母菌株的OUR和CER具有相同的變化趨勢，但是不同拷貝數重組菌的OUR和CER等生理代謝仍有差異，在此僅以不同拷貝數重組菌的OUR為例進行比較，見圖5。

圖5 不同拷貝數畢赤酵母重組菌在補料分批培養中OUR的變化曲線

由圖5可知，不同拷貝數畢赤酵母菌株批培養階段的OUR均不斷增加，1拷貝和6拷貝菌株約達到100.00 mmol·L-1·h-1左右，12拷貝和18拷貝菌株OUR稍低些，僅為88.65 mmol·L-1·h-1和73.99 mmol·L-1·h-1。22 h 時不同拷貝數菌株OUR均下降表明初始甘油已經耗盡，這時以限制性速度補加甘油以繼續增加菌體濃度，在此階段，不同拷貝數菌株的OUR又開始上升。不同拷貝數畢赤酵母菌株誘導之前OUR再次處于一個低峰；補加甲醇適應2 h后，OUR持續上升，約在60 h達到峰值，1拷貝菌株最大達到185.74 mmol·L-1·h-1，分別是6拷貝、12拷貝和18拷貝菌株的1.32倍、1.45倍和1.55倍，并且不同拷貝數菌株誘導后最大OUR都比其甘油階段高，這可能是由于細胞適應甲醇后，菌濃增加，需要更多的氧來維持細胞代謝和蛋白生產，而高拷貝數菌株比低拷貝數菌株OUR低的主要原因可能是高拷貝數菌株細胞生長較慢。

2.4 不同拷貝數重組畢赤酵母細胞存活率比較

在整個發酵過程中以發酵初始細胞的存活率為100%，每24 h取樣1次，共取樣4次，不同拷貝數細胞存活率變化曲線見圖6。

圖6 不同拷貝數畢赤酵母菌細胞存活率變化曲線

由圖6可知，在細胞生長階段和誘導初期，不同拷貝數菌株存活率差異不顯著，均維持在90%以上，這可能是由于在初始階段細胞光密度不高，產生有毒副產物少；但在誘導48 h以后不同拷貝數菌株之間的存活率出現了較大差異，除了1拷貝菌株細胞存活率在90%外，其它拷貝數菌株的存活率均急劇下降，18拷貝菌株細胞存活率下降到78%，而且拷貝數越高存活率下降越明顯。由此表明，基因拷貝數的增加容易引起細胞存活率的下降。

2.5 不同拷貝數畢赤酵母重組菌外源基因穩定性比較

發酵過程中分別在48 h和96 h取樣2次，提取酵母的總DNA，稀釋500倍后分別對GAP基因和PIP基因做定量PCR反應，測定其Ct值。均進行2次平行實驗。由建立的GAP基因和PIP基因標準曲線(圖7)算出PIP與GAP的拷貝數，二者的比值即為該樣品的拷貝數。

圖7 PIP和GAP基因的標準曲線

由圖8可知，在 5 L發酵罐發酵48 h 后，不管是低拷貝數還是高拷貝數菌株的遺傳穩定性均沒有發生顯著變化；發酵96 h后，1拷貝菌株PIP基因拷貝數穩定，6拷貝菌株拷貝數僅發生微小變化，但12拷貝和18拷貝菌株PIP基因的丟失率增加，分別丟失了16.1%和19.4%。這說明在甘油階段和甲醇誘導初期并不影響基因的穩定性，但隨著誘導時間的延長，拷貝數越高基因的不穩定性就越大。

圖8 不同拷貝數畢赤酵母菌的基因穩定性

3 結論

在5 L發酵罐補料分批發酵發現，在甘油階段和甲醇誘導初期，拷貝數對畢赤酵母的生長無顯著影響；在甲醇誘導24 h后低拷貝數菌株(1拷貝和6拷貝)生長不受影響，但高拷貝數菌株(12拷貝和18拷貝)存在生長緩慢、細胞存活率急劇下降的現象；隨著拷貝數的增加，蛋白表達存在先增加后減小的趨勢，12拷貝時達到最大值702 mg·L-1；在甘油階段和甲醇誘導初期不同拷貝數畢赤酵母菌外源基因均表現出很高的穩定性，在誘導后期低拷貝數外源基因穩定性所受影響不大，但高拷貝數菌株外源基因丟失明顯。因此，在利用高拷貝數的重組畢赤酵母菌株進行生產時，應多方考慮尋找到最優表達的拷貝菌株。

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