蓮子心總黃酮的微波輔助提取研究

余其鳳，周文富

(三明學院化學與生物工程系，福建 三明 365004)

蓮子心為睡蓮科多年生水生草本植物蓮(NelumbonuciferaGaertn)的成熟種子蓮子的青嫩胚芽，古名薏，味苦，性寒[1，2]。我國有著豐富的蓮子心資源，質優價廉。現代藥理分析證明，蓮子心具有清心安神、交通心腎、抗心律失常、保護心肌、降血壓、止血抗炎、止咳化痰、治療目赤腫痛等功效[1～6]，其主要成分為蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿、荷葉堿等多種生物堿和木犀草甙、金絲桃甙、蘆丁等黃酮類化合物[1～12]。

黃酮類化合物的傳統提取方法有冷浸法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、堿性水或堿性稀醇提取法等。近年來，微波技術發展很快，不僅可縮短萃取時間、提高萃取效率，還可降低萃取溫度，最大限度地保證萃取目標產物的生物活性和質量[11～28]。

作者在此采用單因素實驗和正交實驗優化了蓮子心總黃酮的微波輔助提取工藝，擬為蓮子心的綜合開發利用提供依據[7，8，17]。

1 實驗

1.1 原料、試劑與儀器

蓮子心，產自福建建寧地區。

蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；95%乙醇；亞硝酸鈉固體；硝酸鋁固體；氫氧化鈉固體；石油醚。所用試劑均為分析純。

LWMC-205型可調功率微波化學反應器，南京陵江科技開發有限責任公司；FA1604N型電子天平、722型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SHB-3型循環水式多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海基瑋試驗儀器設備有限公司；2K-82B型真空干燥箱，上海實驗儀器總廠；800型離心沉淀機(最大轉速4000 r·min-1)，上海手術器械五廠；H.H.S型電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械五廠；RE-52D型旋轉蒸發儀，上海博經經貿公司；UV-2550型紫外可見分光光度計，廈門精藝興業科技有限公司；360型FTIR紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.2 微波提取蓮子心總黃酮方法及供試品溶液的制備

準確稱取1 g蓮子心粉末(過60目篩)于錐形瓶中，按要求加入一定量不同質量濃度的乙醇，搖勻，將瓶口用保鮮膜封住，40℃水浴浸泡30 min后，在一定功率下微波提取一定時間，減壓抽濾，濾液定容至50 mL，搖勻，即得供試品溶液。

單因素實驗：乙醇質量濃度為65%、固液比為1∶25(g∶mL)、微波輻射功率為320 W、微波輻射時間為30 s、微波提取次數為3次，固定其它條件不變，依次考察上述各個因素對蓮子心總黃酮提取率的影響。

正交實驗：在單因素實驗的基礎上，選擇乙醇質量濃度、固液比、微波輻射時間和微波輻射功率作為考察因素，以提取率為考核指標，進行L9(34)正交實驗，以進一步優化微波輔助提取蓮子心總黃酮的工藝條件。正交實驗的因素與水平見表1。

表1 微波輔助提取正交實驗的因素與水平

1.3 分析與檢測

以蘆丁為基準物，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉為顯色劑，根據黃酮化合物母核中含有堿性氧原子，能與游離的鋁離子生成黃色絡合物，在亞硝酸鈉的堿性溶液中呈紅橙色的特性進行比色測定，方法簡便、準確、靈敏度高。

1.3.1 標準溶液的制備

精密稱取真空干燥至恒重的蘆丁標準品10.2 mg，加入適量的65%乙醇在超聲波清洗器上超聲10 min使之溶解完全后定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得0.102 mg·mL-1的蘆丁標準溶液，置于冰箱貯存，備用。

1.3.2 最大吸收波長的確定

對蘆丁標準溶液和供試品溶液顯色后(以不加標準溶液和供試品溶液的試液為參比溶液)，用紫外可見分光光度計在200～600 nm波長范圍進行掃描。結果表明，蘆丁標準溶液和供試品溶液均在500 nm 處有最大吸收峰，因此選擇500 nm 為測定波長。

1.3.3 標準曲線的繪制

精密量取蘆丁標準溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加65%乙醇至5 mL；分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再分別加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后分別加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，并分別用65%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，在500 nm處測定吸光度。

以蘆丁含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線(見圖1)，并進行線性擬合，得到線性回歸方程為：A=-2.6280×10-4+ 0.01346c，R=0.9999。

圖1 蘆丁標準溶液標準曲線

1.3.4 蓮子心總黃酮提取率的測定

精密吸取供試品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶，按1.3.3方法測定吸光度。由于75%、85%的乙醇提取液中有一定量的色素存在，測吸光度時應先除色素，否則會影響吸光度的測定。根據回歸方程，按下式計算蓮子心總黃酮提取率。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 乙醇質量濃度對蓮子心總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 乙醇質量濃度對蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇質量濃度的增大，蓮子心總黃酮提取率不斷升高；當乙醇質量濃度增大到65%時，提取率達到最高；繼續增大乙醇質量濃度，提取率反而降低。其原因可能與黃酮類化合物的極性有關，不同質量濃度的乙醇極性不同，蓮子心總黃酮的極性可能和65%乙醇的極性相當，根據相似相溶原理，乙醇質量濃度為65%時總黃酮的提取率最高；當乙醇質量濃度大于65%時，提取液中會帶入色素和其它脂溶性成分，這些雜質與黃酮類化合物競爭與乙醇-水分子溶液體系結合，導致總黃酮提取率下降。

2.1.2 微波輻射功率對蓮子心總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 微波輻射功率對蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖3可知，當微波輻射功率小于400 W時，蓮子心總黃酮提取率隨微波輻射功率的增大而升高。這可能是因為當微波輻射功率較低時，微波輻射對細胞膜的破壞作用較小，分子運動也不劇烈，故總黃酮提取率不高；隨著微波輻射功率不斷增大，分子運動加劇，細胞膜破碎程度加大，另外，微波的選擇性加熱性能也起到了一定的作用，總黃酮提取率逐漸升高；但微波輻射功率太大時，細胞膜并不會無限制破碎，而微波對細胞內物質的選擇性加熱性能差異則減小，一些易溶于水的物質先被溶出，從而造成總黃酮提取率降低；此外大功率所產生的強熱效應也可能使一些黃酮類化合物的結構遭到破壞，導致總黃酮提取率降低。

2.1.3 固液比對蓮子心總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 固液比對蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著溶劑量的增大，蓮子心總黃酮提取率逐漸升高；固液比達到1∶25后，總黃酮提取率增加緩慢，逐漸趨于穩定。這是因為，溶劑量較小時，蓮子心總黃酮尚未完全溶出而體系已達到飽和，因此總黃酮提取率比較低；隨著溶劑量的增大，蓮子心總黃酮不斷溶出，直至達到飽和，因此總黃酮提取率也逐漸升高；但溶劑用量過大會造成浪費，并給提取液蒸發濃縮帶來不便。因此，溶劑用量不宜過大。

2.1.4 微波輻射時間對蓮子心總黃酮提取率的影響(圖5)

圖5 微波輻射時間對蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著微波輻射時間的延長，蓮子心總黃酮提取率不斷升高；但每次輻射時間超過30 s后提取率開始下降。這是因為，微波輻射時間過短，黃酮類物質還未充分溶出；隨著微波輻射時間的延長，總黃酮溶出量逐漸增大，提取率逐漸升高；繼續延長微波輻射時間，未溶出的黃酮類物質量很少，其它雜質可能增多，導致提取率下降。

2.1.5 提取次數對蓮子心總黃酮提取率的影響(圖6)

圖6 提取次數對蓮子心總黃酮提取率的影響

由圖6可知，提取次數對蓮子心總黃酮的提取率影響不大。從經濟效益考慮，提取1次即可。

2.2 正交實驗結果與分析[15](表2)

由表2可看出，各因素對蓮子心總黃酮提取率的影響大小依次為：乙醇質量濃度>微波輻射時間>微波輻射功率>固液比；較優工藝參數組合為A3B3C2D2，即乙醇質量濃度65%、固液比1∶35(g∶mL)、微波輻射功率400 W、微波輻射時間30 s×3。

表2 微波輔助提取正交實驗的結果與分析

根據單因素實驗和正交實驗結果，綜合考慮提取效率及成本等，確定最優工藝條件為：乙醇質量濃度65%、固液比1∶25、微波輻射功率400 W、微波輻射時間30 s×3。在上述條件下進行8次驗證實驗，蓮子心總黃酮的平均提取率為1.021%。

此外，用石油醚萃取蓮子心提取液時，石油醚層仍呈無色透明狀態，表明65%乙醇所提取的提取液中無脂溶性色素存在。

2.3 同產地不同批號(日期)蓮子心總黃酮含量的比較

準確稱取3種不同批號的蓮子心粉末1 g分別置于錐形瓶中，在最佳工藝條件下微波提取，測定總黃酮含量，結果見表3。

表3 同產地不同批號蓮子心的總黃酮含量

由表3可看出，3種同產地不同批號蓮子心的總黃酮含量略有差異，具體原因有待進一步探討。

2.4 不同提取方法提取效果的比較

對微波輔助提取法與乙醇浸提法、水浸提法的工藝條件及提取率進行對比，結果見表4。

表4 3種提取方法提取效果的比較

由表4可看出，與傳統乙醇浸提法和水浸提法相比，微波輔助法提取蓮子心總黃酮的提取率高、耗時短[9]。

2.5 結構表征

2.5.1 紫外光譜分析[24～27](圖7)

圖7 蘆丁標準品(a)與蓮子心提取物(b)的紫外吸收光譜

由圖7可知，蘆丁標準品在240～280 nm和300～400 nm兩波帶各有一個吸收峰，蓮子心提取物在這兩個譜峰帶也有吸收且吸收帶的位置、強度和形狀與蘆丁標準品非常相似，表明蓮子心提取物的骨架和官能團結構與蘆丁相似。

2.5.2 紅外光譜分析[19～28](圖8)

圖8 蘆丁標準品(a)和蓮子心提取物(b)的紅外光譜

由圖8可知，蘆丁標準品與蓮子心提取物的紅外光譜圖的特征吸收峰一致：3400 cm-1為-OH的伸縮振動吸收峰，峰形寬大，吸收峰極強，證明有酚羥基或糖上的羥基存在；1600～1500 cm-1范圍有若干吸收峰，為苯環C-C骨架伸縮振動吸收峰，說明有苯環存在；2930 cm-1為C-H的伸縮振動吸收峰，吸收峰的強度較小，說明飽和碳上的氫較少；1660 cm-1左右有較強的吸收峰，為C=O的伸縮振動吸收峰；1050 cm-1左右為C-O的伸縮振動吸收峰，峰較強。這些表明蓮子心提取物含有與蘆丁相似的成分，屬于黃酮類化合物。

3 結論

(1)通過單因素實驗和正交實驗確定微波輔助提取蓮子心總黃酮的最優工藝條件為：乙醇質量濃度65%、固液比1∶25(g∶mL)、微波輻射功率400 W、微波輻射時間30 s×3，此時蓮子心總黃酮提取率達到1.021%。

(2)同產地不同批號蓮子心總黃酮的含量不同。

(3)微波輔助提取法與傳統乙醇浸提法、水浸提法相比，耗時短、提取率高，具有較好的發展前景和應用潛力。

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