超濾法分離提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白

李燕妮

(濱州醫學院藥學院，山東 煙臺 264003)

硫酸軟骨素(CS)是關節軟骨處蛋白多糖形成所必需的一類粘多糖，平均分子量為25～55 kDa，主要用于某些神經性頭痛、神經痛、關節痛、偏頭痛、動脈粥樣硬化以及由鏈霉素引起的聽覺障礙及肝炎的輔助治療。實驗表明，口服硫酸軟骨素可以逐步緩解關節變性病癥狀，減少對非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的依賴[1]。通常認為硫酸軟骨素是通過提高內源性合成和防止酶降解關節粘多糖來改善關節功能。

風濕性關節炎是人體常見的自身免疫性疾病，其病因是T細胞對關節軟骨的抗原反應所致。而Ⅱ型膠原蛋白是關節軟骨中的主要蛋白，因而是潛在的自身抗原。雞Ⅱ型膠原蛋白具有類似的抗原型，口服后能誘導T細胞產生免疫耐受，從而抑制T細胞介導的自身免疫性疾病。口服小劑量雞Ⅱ型膠原蛋白可緩解風濕性關節炎病人疼痛、僵直等癥狀[2]。

雞胸軟骨中富含硫酸軟骨素和純度較高的Ⅱ型膠原蛋白[3]，與牛的氣管軟骨和鯊魚軟骨相比，去除雞胸肉后的雞胸軟骨非常容易收集。作者在此先用木瓜蛋白酶處理雞胸軟骨，然后采用超濾技術分離提取硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白[4～6]。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

雞胸軟骨。

木瓜蛋白酶(Papain)；硫酸軟骨素標準品，中國藥品生物制品檢定所；其它試劑均為分析純。

高速冷凍離心機，德國Heraeus公司；Minimate TFF system型超濾機，英國PALL公司；7550型紫外可見分光光度計，惠普上海儀器有限公司。

1.2 方法

超濾法分離提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白的工藝流程如圖1所示。

圖1 超濾法提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白的工藝流程

1.2.1 雞胸軟骨的水解

取1 kg冷凍后的鮮雞胸軟骨，勻漿后加入5000 mL純化水，調pH值至7.5～8.0，加入4.0 g(相當于雞胸軟骨質量的0.4%)木瓜蛋白酶于50℃水解6 h，調節pH值至6.0，85℃滅活10 min，水解液離心，過濾，澄清。

1.2.2 硫酸軟骨素的分離提取

雞胸軟骨水解液在超濾前需進行預處理以去除不溶雜質，降低超濾膜受損的風險。由于硫酸軟骨素的分子量為20～30 kDa，所以本實驗先用0.45 μm微孔濾膜澄清水解液，再分別選用截留分子量為8 kDa、10 kDa和30 kDa的超濾膜分離純化硫酸軟骨素，比較硫酸軟骨素收率和超濾時間，以確定分離提取硫酸軟骨素的超濾膜規格。

1.2.3 Ⅱ型膠原蛋白的分離提取

水解后的Ⅱ型膠原蛋白產物為分子量為1～5 kDa的多肽，所以超濾后的透過液即為分離得到的Ⅱ型膠原蛋白，選用截留分子量為0.6 kDa、1 kDa和3 kDa的超濾膜分離提取Ⅱ型膠原蛋白，比較Ⅱ型膠原蛋白收率和超濾時間，以確定分離提取Ⅱ型膠原蛋白的超濾膜規格。

1.3 分析方法

硫酸軟骨素含量采用CPC(十六烷基氯化吡啶)滴定法測定；蛋白質含量采用福林酚法測定；無機鹽含量采用灼燒殘渣法測定。

2 結果與討論

2.1 雞胸軟骨的主要成分

將鮮雞胸軟骨充分水解后，分別用CPC滴定法、福林酚法和灼燒殘渣法測定硫酸軟骨素、Ⅱ型膠原蛋白和無機鹽的含量，依次為5.2%、5.1%、2.5%。

2.2 超濾工藝的確定

合適的超濾膜可以在最大程度截留處理對象(這里指硫酸軟骨素)的同時，將盡可能多的雜質分開。超濾膜截留分子量較小，會實現更高的收率，但膜通量也會有所下降，從而延長了處理時間。因此，膜通量和選擇性是兩個相互矛盾的參數，必須綜合考察膜通量和選擇性，以選擇最適合的膜組件。

2.2.1 硫酸軟骨素的分離提取

取澄清后的雞胸軟骨水解液分成等體積的3份，控制超濾膜進口壓力為0.3 MPa、溫度為10℃，在回流液中補加純化水，等體積(保持回流液總量不變)超濾至透過液電導率低于600 μS·cm-1時，比較3種規格超濾膜對硫酸軟骨素的收率和超濾時間，結果見表1。

由表1可見，采用截留分子量為8 kDa和10 kDa的超濾膜分離提取硫酸軟骨素，收率較高，30 kDa的超濾膜則有部分透過。但由于截留分子量為8 kDa的超濾膜耗時較長，并且由于截留分子量小，對較大分子量雜質的除去效果不如10 kDa的超濾膜。因此，選擇截留分子量為10 kDa的超濾膜分離提取硫酸軟骨素，收率達97.1%。

表1 提取硫酸軟骨素用超濾膜的選擇

超濾可以分離除去大部分的無機鹽和小分子肽，并通過檢測透過液電導率反映除去效果。隨著超濾時間的延長，回流液中蛋白質或肽含量逐漸降低；但即使無時間限制地超濾下去，最終還是有大約20%(以軟骨總蛋白質質量計)的蛋白質留在了10 kDa超濾膜的濃縮液里。這是因為木瓜蛋白酶水解后的硫酸軟骨素通常仍帶有1～5個氨基酸殘基，故超濾不能完全去除硫酸軟骨素中的蛋白質。

2.2.2 Ⅱ型膠原蛋白的分離提取

取超濾后的透過液分成等體積的3份，控制超濾膜進口壓力為0.6 MPa、溫度為10℃，在回流液中補加純化水，等體積超濾至透過液電導率低于200 μS·cm-1后，比較3種規格超濾膜對Ⅱ型膠原蛋白的收率和超濾時間，結果見表2。

表2 提取Ⅱ型膠原蛋白用超濾膜的選擇

由表2可見，采用截留分子量為0.6 kDa、1 kDa和3 kDa的超濾膜分離提取Ⅱ型膠原蛋白，收率依次降低，但沒有顯著差異，由于截留分子量為3 kDa的超濾膜耗時最短，因此，選擇截留分子量為3 kDa的超濾膜分離提取Ⅱ型膠原蛋白，收率達95.1%。

3 結論

以雞胸軟骨為原料，用木瓜蛋白酶處理雞胸軟骨以實現高效率的水解，水解液用截留分子量為10 kDa的超濾膜，在0.3 MPa、10℃分離提取硫酸軟骨素，收率達97.1%；超濾透過液用截留分子量為3 kDa的超濾膜，在0.6 MPa、10℃分離提取Ⅱ型膠原蛋白，收率達95.1%。超濾技術可以實現常溫分離和濃縮，能耗低，回收率高，操作簡單易行，易于工業化生產。

[1] Weiner H L. Oral tolerance：Immune mechanisms and treatment of autoimmune diseases[J]. Immunology Today，1997，18(7)：335-343.

[2] Cho So Yean，Sim Joon-Soo，Jeong Choon Sik，et al. Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice[J]. Biol Pharm Bull，2004，27(1)：47-51.

[3] Luo X M，Fosmire G J，Leach R M. Chicken keel cartilage as a source of chondroitin sulfate[J]. Poultry Science，2002，81(7)：1086-1089.

[4] 李燕妮.超濾法分離純化刺參酸性粘多糖工藝研究[J].化學與生物工程，2009，26(1)：39-41.

[5] 紀存朋，于建生，黃淑燕.膜系統在生物技術中應用的研究進展[J].化學工業與工程技術，2009，30(5)：24-28.

[6] 姜玉紅，張翊.硫酸軟骨素含量測定的法定方法[J].食品與藥品，2009，11(3)：68-70.