模擬微重力環境對大腸桿菌形態與表面超微結構的影響研究

王 偉，薛小平，楊 慧，謝 瓊

(1.西北工業大學生命科學院，陜西 西安 710072；2.中國航天員訓練中心醫監醫保研究室，北京 100094)

隨著航天事業的發展，對空間環境的開發和利用已成為各國競爭的重要領域之一。與地面環境相比，空間環境的主要特征包括微重力、宇宙輻射、高真空等物理因素。在近地空間條件下，由于航天器位置調整、軌道高度、航天員活動等因素引起的重力級別一般為10-6～10-4g，因此飛行器中各種物體均處于微重力狀態，許多物理現象如對流、浮力、流體靜壓力、沉降等將會消失，從而對生物體機能產生重大影響。因此，空間失重環境對生物體的影響及其作用機理已成為空間生命科學研究的一項重要內容。

微生物是地球上分布最廣泛的生物類群，在人類進入空間飛行的過程中，各種微生物也隨同被攜帶進太空，有研究表明，進入太空中的微生物受微重力等因素的影響，其種群結構、生理生化性狀等會發生變化，原本對人體和環境無害的微生物種群會在毒力、致病性、抗生素敏感性等方面發生變異，如不加以控制將嚴重危害宇航員健康，腐蝕電子元器件、影響航天精密儀器的正常使用。鑒于此，利用微生物開展空間失重生物學效應的研究具有重要的理論和實際意義。

作者采用模擬微重力生物效應回轉器處理常見的大腸桿菌(E.coli)，利用掃描電鏡[1]和原子力顯微鏡[2～5]研究模擬微重力環境對其形態和表面超微結構的影響，以期為微重力環境下細菌的生物學效應研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌株與培養基

大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，自行保存(西京醫院細菌室惠贈)。

LB液體培養基：Tryptone 10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g，加入800 mL蒸餾水后用5 mol·L-1鹽酸調節pH值至7.0，用雙蒸水定容至1 L，121℃、103.42 kPa下高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2 儀器

模擬微重力生物效應回轉器，中國科學院生物物理研究所；超凈工作臺，蘇州凈化設備總廠；生化培養箱，海爾公司；5500 AFM型原子力顯微鏡，Agilent Picoplus；S-3700N型掃描電鏡，Hitachi。

1.3 細菌的培養與模擬微重力處理[6]

將E.coli接種于5 mL液體LB培養基中，于37℃、220 r·min-1過夜培養；取50 μL過夜菌接種于5 mL新鮮LB液體培養基中，振蕩培養2 h至對數生長期，按1∶300接種于新鮮LB液體培養基中并充滿樣品瓶。將樣品瓶置于隔水培養箱中的回轉器上，打開回轉器的開關，于60 r·min-1、37℃下持續培養60 d。對照樣品置于培養箱中靜置培養。

1.4 掃描電鏡樣品制備及觀察[7]

(1)收集菌體：取培養物1.5 mL，4000 r·min-1離心5 min，棄上清；(2)固定：沉淀中加入1 mL 2.5%戊二醛固定液，固定24 h(以上)→磷酸鹽緩沖溶液清洗3次→1%鋨酸4～6 h→緩沖溶液清洗3次→乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、85%、95%各1次，100% 2次，15～20 min·次-1)→乙酸異戊酯置換2次(20 min·次-1)。每步均需4000 r·min-1離心3～5 min，棄上清，加入下一種試劑，滴管來回吸幾下，打散菌塊；(3)臨界點干燥：將固定、清洗過的細菌放入臨界點干燥器樣品室，進行CO2臨界點干燥。每次可同時處理10～20種不同菌樣(需用液態CO2置換2～3次)；(4)離子濺射金：將干燥后粉末狀純菌體倒入平皿，輕搖盡量分散。碳導電膠帶一面粘在1/4蓋玻片上，另一面倒扣輕壓在菌體粉末上，翻正后用鑷子或牙簽將菌體輕輕刮薄鋪平。離子濺射金后，即可進行掃描電鏡觀察。

1.5 原子力顯微鏡樣品制備及觀察[8～14]

取1.5 mL培養物加入無菌離心管，4000 r·min-1離心10 min，棄上清，將收集的細菌樣本重新懸浮于1 mL 0.9%生理鹽水中，4000 r·min-1離心5 min，棄上清，于1 mL 2.5%戊二醛中4℃固定。吸去管中的2%戊二醛，加入1 mL雙蒸水重懸菌體，4000 r·min-1離心5 min，洗滌，反復3次，去除雜質，確保不會有鹽結晶的出現，1∶1000稀釋，吸取少量細菌懸液，小心滴于新鮮剝離的云母片上(沒有云母片可用蓋玻片代替，蓋玻片需用酸泡6 h以上，雙蒸水洗凈，無水乙醇擦拭表面)，待水分自然風干(或37℃干燥)后，即可進行原子力顯微鏡觀察。

2 結果與討論

2.1 掃描電鏡分析[6]

實驗發現，對照組菌體為典型的短棒狀或短圓柱狀，形態均一，菌體飽滿、充盈、表面圓潤光滑。經模擬微重力回轉器處理后，菌體發生了明顯的變化，其形態變得多樣，長度變短，多呈現出短立方體狀，菌體表面凹陷、邊界棱角分明，同時，菌體間的絲狀粘連物明顯增多。

對照組和處理組菌株的掃描電鏡照片見圖1。

圖1 對照組(a)和處理組(b)菌株的掃描電鏡照片

2.2 原子力顯微鏡分析[15～19]

實驗發現，正常大腸桿菌為短桿狀，大小為0.5 μm×(1～3) μm，周身有鞭毛，但表面相對平滑均勻，經模擬微重力回轉器處理后，菌體表面光潔，且有明顯的凹凸，菌毛明顯減少。

對照組和處理組菌株的平面圖見圖2。

圖2 對照組(a)和處理組(b)菌株的平面圖

由圖2可以看出，處理前后大腸桿菌表面變化明顯。三維立體圖直觀地將這種變化表現出來(圖3)。

圖3 對照組(a)和處理組(b)菌株的三維立體圖

對對照組和處理組菌株分別進行剖面分析處理，其長度測量圖和長度測量曲線分析見圖4、圖5。

圖4 對照組(a)和處理組(b)菌株的長度測量圖

圖5 對照組(a)和處理組(b)菌株的長度測量曲線

由圖5可知，正常大腸桿菌菌體厚度最大值約為60 nm左右，而處理后大腸桿菌的菌體厚度最大值約為135 nm左右。通過菌體長度對比也發現，處理后大腸桿菌菌體變短。

處理后大腸桿菌的局部放大平面圖、三維立體圖、長度測量圖及長度測量曲線見圖6。

圖6 處理后菌株的局部放大平面圖(a)、三維立體圖(b)、長度測量圖(c)和長度測量曲線(d)

由圖6可知，處理后大腸桿菌的凹陷約有40 nm。

回轉器處理后大腸桿菌的原子力掃描圖見圖7[14，19，20]，大小為45 μm×45 μm。

圖7 處理后大腸桿菌的原子力掃描圖

由圖7可知，回轉器處理后大腸桿菌的菌體出現凹陷，并不是單一的某個菌體發生突變，而是一個普遍的現象。

2.3 討論

地球上的生物體總是生活在一定的重力環境中，其周圍重力環境的改變(例如：失重)對生物體生長、發育以及繁殖過程等有一定潛在性影響。隨著科學技術的進步，對太空環境的探索和開發已成為各國競爭的目標。太空中不可避免地涉及到失重環境，失重環境對生物體有怎樣的影響，如何合理利用失重環境，將失重帶來的損失降到最小，是各國科學家研究的重點。

任何外界環境(生物、物理或化學)因素作用于生物體，首先引發遺傳性變異，繼而顯現表型性狀改變，并且呈現出緩慢、累積的效應，需要通過1～2代、甚至數代的世代交替才能表現出來。微生物除體積微小、結構簡單、易于變異外，還具有繁殖速度快、世代交替周期短的特點，因此以微生物為模式生物研究某些特殊和極端環境的生物學效應具有明顯的優勢。

本研究通過比對實驗，觀察到失重環境可以影響微生物的整體形態，還可以引起微生物表面超微結構的改變[1，2]，這種變化的生物學意義何在，對細菌的致病性、藥物敏感性和抗性有何影響，對于人類利大于弊還是弊大于利，還需要進一步深入研究。

3 結論

采用模擬微重力生物效應回轉器處理大腸桿菌ATCC 25922，利用掃描電鏡和原子力顯微鏡研究回轉器模擬微重力環境對細菌的形態及表面超微結構的影響。結果發現，模擬微重力條件下，處理菌株與對照菌株相比在形態、長寬度、表面超微結構等方面有明顯改變。表明微生物的形態和表面超微結構與微重力的變化有關。

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