煙曲霉次級代謝產物抗菌與抗腫瘤活性研究

王 胤

(西南大學藥學院，重慶 400716)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)系子囊菌綱(Ascomycetes)曲霉屬的真菌，在自然界中分布廣泛。其分生孢子漂浮在空氣中，通過呼吸道進入人體，主要引起肺部感染，進而引起侵襲性曲霉病[1]。研究表明其代謝產物具備一定開發(fā)為活性藥物的潛力，迄今為止已從煙曲霉代謝產物中分離出多個化合物，但由于毒性較大或藥理活性一般、產物量甚微等原因，開發(fā)難度很大[2]。近年來發(fā)現(xiàn)其中一些化合物具有新的藥理活性[3～6]，尤其在抗腫瘤等方面有著較為積極的意義，既可用來研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉移的機制，又可通過結構改造以降低副作用獲得全新的抗腫瘤藥物。

作者在此對煙曲霉次級代謝產物進行了初步活性研究，擬為進一步確定其活性單體成分奠定基礎。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

小牛血清(FCS)，杭州四季清公司；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，Hyclone公司；DMSO，Sigma公司；MTT[四氮唑鹽，3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]。

My Cycler Thermal Cycler型PCR儀、Model 680型酶標儀，美國BIO RAD；DYY-8C型雙向電泳儀，北京六一；KYC-1102型搖床，上海福瑪；微量高速離心機，長沙湘儀。

1.2 菌株與培養(yǎng)基

菌株從三峽庫區(qū)土壤中分離得到，命名為IMBSX-28，經鑒定為煙曲霉(Aspergillusfumigatus)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基，PD培養(yǎng)基)：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1 L，加葡萄糖20 g，滅菌30 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加水至1 L，溶解滅菌30 min。

改良馬丁培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母浸出物2 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，加水至1 L，溶解滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化與鑒定

采用平板法和稀釋劃線法在PDA平板上對菌株進行分離純化。通過形態(tài)學分析、對提取菌體rDNA進行PCR擴增再進行ITS序列分析[7]，鑒定該菌為Aspergillusfumigatus。

1.3.2 菌株發(fā)酵

將純化后的菌株涂到PDA平板上生長7 d，挑取適量菌體至裝有50 mL已滅菌 PD培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在28℃、220 r· min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)7 d。共發(fā)酵140瓶。

1.3.3 發(fā)酵產物的提取

將發(fā)酵7 d的菌體與發(fā)酵液離心過濾。將發(fā)酵液濃縮2/3，加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液濃縮至干，得煙曲霉胞外次級代謝產物乙酸乙酯部分。菌體加入甲醇進行破碎并萃取3次，每次24 h，合并萃取液，得煙曲霉胞內次級代謝產物，減壓濃縮至不含甲醇，再加入乙酸乙酯提取，得到菌體提取物浸膏。

1.3.4 抗菌活性分析

用甲醇將發(fā)酵液與菌體乙酸乙酯提取部分濃度調至1 mg · mL-1。抗菌活性采用瓊脂—紙片擴散(KB)法測定。指示菌包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和白色念珠球菌(Candidaalbicans)。指示細菌和指示真菌分別用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。用100 μg · mL-1卡那霉素和50 μg · mL-1制菌霉素作為抗菌實驗的陽性對照。通過觀察煙曲霉次級代謝產物對指示細菌和指示真菌生長的抑制來分析抗菌活性。

1.3.5 抗腫瘤活性分析

人肺癌A549細胞用 RPMI-1640培養(yǎng)基 (含 10%小牛血清)常規(guī)繼代，在通有5%(體積分數(shù)) CO2的細胞培養(yǎng)箱內，于37℃培養(yǎng)。采用MTT法測試煙曲霉胞內次級代謝產物對A549細胞增殖的抑制作用，同時通過顯微鏡下細胞形態(tài)學檢測，初步判斷有無細胞凋亡誘導、壞死性細胞毒等活性。

MTT法檢測抗腫瘤活性的具體步驟為：將處于對數(shù)生長期的A549細胞消化接種于96孔細胞板，細胞濃度為0.5×105個· mL-1，每孔200 μL，細胞接種48 h后加入20 μL不同濃度的煙曲霉次級代謝產物粗提液，使終濃度(μg · mL-1)分別為：400、200、100、50、25、12.5。每個濃度設5個復孔，以同樣體積甲醇(代謝產物溶劑)作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后每孔加入10 μL 5 mg · mL-1MTT，37℃作用4 h，再加入100 μL DMSO，室溫下振蕩10 min，用酶標儀在490 nm 波長下測定吸光度OD值。根據(jù)OD值計算抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結果與討論

2.1 菌株分離與鑒定

煙曲霉菌體為墨綠色，在 PDA平板上培養(yǎng)2 d長出白色較長菌絲，第3 d后變成綠色并產孢。通過ITS序列分析，用ITS1和ITS4作為PCR引物進行擴增，并測序。通過美國 NCBI網(wǎng)站在線的 Genbank獲取與測得的序列相似的多個序列，相似度最接近的為99%。鑒定該菌為Aspergillusfumigatus。

2.2 抗菌活性(表1)

表1 煙曲霉IMBSX-28提取物抗菌活性分析

由表1可知，同等條件下煙曲霉發(fā)酵液與菌體的乙酸乙酯提取部分都具有一定的抗菌活性，但均限于對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)活性較強，對其它菌(革蘭氏陰性菌和真菌)則無活性。

2.3 抗腫瘤活性

以煙曲霉IMBSX-28提取物處理人肺癌A549細胞24 h，測定其對細胞增殖的抑制活性。結果發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌體的乙酸乙酯提取部分在 200 μg · mL-1左右時能夠顯著抑制人肺癌 A549細胞的增殖，對癌細胞有很強的抑制作用，抑制率為100%，IC50為(228±0.52)μg · mL-1。而胞外發(fā)酵液的乙酸乙酯提取部分基本沒有抗人肺癌A549細胞的作用。

菌體提取物對A549細胞作用24 h后的細胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌體提取物作用24 h后A549的細胞形態(tài)

2.4 討論

對于煙曲霉次級代謝產物的研究已有一些文獻報道，并且分離得到了不同的化合物。研究主要針對以下幾個方面：(1)不同來源煙曲霉的代謝產物不同。已有對從海洋分離出的煙曲霉進行次級代謝產物研究的報道。(2)不同發(fā)酵條件獲得的代謝產物也不同。這方面文獻報道較少。(3)更好的分離純化技術的應用，對以前獲得的很少量的物質也可以進行純化和結構分析。本實驗發(fā)現(xiàn)，對于煙曲霉來說，更多的活性成分存在于胞內，通過對其胞內代謝產物的研究應該可以找到相應的活性單體化合物。因此，后續(xù)研究將對活性較明顯的胞內組分，通過萃取、柱層析、制備高效液相色譜等分離純化手段進行分離與純化，得到不同的單體組分；然后再通過質譜、核磁、紅外等不同手段，進行結構解析，了解相應活性物質的詳細結構。

3 結論

通過對煙曲霉次級代謝產物活性的初步研究，發(fā)現(xiàn)煙曲霉的次級代謝產物成分比較復雜，其中很多具有藥理活性，特別是有一定的抗菌和抗腫瘤活性，且活性成分主要存在于胞內。因此，煙曲霉次級代謝產物的研究對抗腫瘤藥物的開發(fā)具有一定意義。

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