中心組合設計優化東方擬無枝酸菌發酵生產萬古霉素的微量金屬離子

彭 哲，張嗣良

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

萬古霉素是由東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)產生的一種糖肽類抗生素，對青霉素 G和多種抗生素耐藥的金黃色葡菌球菌、表球菌以及溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎球菌及腸球菌等均有強大的抗菌作用，對厭氧的難辨梭狀芽孢桿菌亦有較好的抗菌作用，對炭疽桿菌、白喉桿菌等亦敏感[1]。20世紀80年代隨著β-內酰胺類抗生素的大量使用，由甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐漸流行，萬古霉素是目前臨床上用于治療由MRSA引起的嚴重感染疾病的重要藥物，愈來愈引起人們的重視[2]。無機鹽在萬古霉素的發酵生產過程中有著顯著的作用[3]，培養基中加入CaCl2、CuSO4·5H2O可以促進萬古霉素的產生[4]；不同的微量金屬離子對萬古霉素的產生影響不同；亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸是萬古霉素的前體物質[5]。

對發酵過程金屬離子的篩選優化方法有很多。部分因子設計法是一種2水平的實驗設計方法，能夠通過比全因子實驗次數少得多的實驗，從大量影響因子中篩選出重要的因子，根據實驗數據擬合出一次多項式，然后通過最速上升實驗(Steepest ascent design)確定最大響應區域，以便利用響應面法進一步優化[6]。

中心組合設計是在全因子設計或部分因子設計的基礎上添加2k個軸向點和中心點，以得到更為精確的實驗預測模型[7]。

付啟偉等[8]應用26-2部分因子設計法優化了StreptomycesspiramyceticusWSJ-1-195發酵生產必特螺旋霉素的基礎培養基，必特螺旋霉素的效價從173 μg·mL-1提高到 1880 μg·mL-1。熊智強等[9]應用中心組合設計對鏈霉菌702搖瓶培養紅谷霉素進行了優化，發酵液紅谷霉素效價達到1500 μg·mL-1，比優化前提高了3.08倍。

作者在此依次通過部分因子析因設計、最速上升實驗、中心組合設計，并利用統計學軟件 Minitab對實驗數據進行分析，確定東方擬無枝酸菌發酵48 h生產萬古霉素的培養基中微量金屬離子的濃度，以期為萬古霉素的工業化生產奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種

東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis) V-0704由華北制藥華勝公司提供。

1.2 培養基

分離平板(斜面)培養基，即高氏1號合成培養基(g·L-1)：可溶性淀粉20，NaCl 0.5，KNO31，K2HPO4·3H2O 5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，瓊脂粉 15，pH值7.2～7.4。

種子培養基(g·L-1)：酵母粉 3，麥芽提取物 3，蛋白胨 11，葡萄糖 17，pH值6.8。用工業用水配制。

發酵培養基(g·L-1)：麥芽糖20，葡萄糖15，玉米油15，酵母粉0.568，棉籽餅粉6.98，黃豆餅粉23.3。用工業用水配制，0.1 MPa、121℃下滅菌20 min。

1.3 培養方法

分離平板培養條件：培養溫度28℃，培養時間依菌落的生長情況而定。

種子搖瓶培養條件：培養溫度28℃，裝液量40 mL/750 mL，搖床轉速220 r·min-1，培養時間22～24 h(視菌體生長情況而定)，采用孢子接種培養。

發酵搖瓶培養條件：培養溫度33℃，裝液量20 mL/250 mL，接種量6%，搖床轉速250 r·min-1，培養時間72 h。

1.4 檢測方法

取發酵液5.0 mL于100 mL容量瓶中，用pH值1.8的硫酸稀釋定容至刻度，搖勻，用雙層定性中速濾紙過濾；再用0.45 μm的微孔濾膜過濾。濾液用于HPLC檢測。

2 結果與討論

2.1 25-1部分因子析因設計

在單因子實驗確定好因子及其范圍的基礎上進行2水平篩選實驗。

當2k析因設計的因子個數增加時，所需的實驗次數會迅速增加。本實驗若選用25析因設計需要設計32次實驗。部分因子析因設計是合理地假定某些高階交互作用可被忽略，而主效應和低階交互作用的信息可以通過只做完全析因實驗的一部分求得。25-1部分因子析因設計是在2水平實驗設計采用有5個實驗因子的每個實驗組合重復2次的1/2部分實驗設計。是在忽略三階以上的相互作用的基礎上進行，它可以在考察單個因子的效用及2因子的效用時沒有偶聯重疊的相，并且每個組合重復了2遍，這樣可以估計由略微不同的實驗條件導致的實驗誤差。以實驗誤差為基準，確定數據分析中觀測到的差異是否為統計學意義的不同。這對于實驗因子的篩選十分重要[7]，本實驗采用的設計完全符合實驗的要求。

本實驗嘗試利用25-1部分因子析因設計從所選的5個因子(5因子的編碼與實際濃度見表1)中篩選出對效價影響最顯著的幾個因子，再對所選出的因子進行更為細致的優化，25-1部分因子析因設計結果見表2。

表1 25-1部分因子析因設計的因子編碼與實際濃度

表2 25-1部分因子析因設計結果

對25-1部分因子析因設計用Minitab統計學軟件在置信度為95%下進行方差分析，以P值<0.05認為有顯著作用，結果見表3。

表3 25-1部分因子析因設計的方差分析

由表3可以看出，在忽略三階及更高階交互作用的情況下，Co2+及Mo6+有顯著作用。由于Co2+、Mo6+的效用顯示為負值，因此下一步選取Co2+、Mo6+為主要因素進行最速上升實驗時要向金屬離子濃度減小的方向進行。

2.2 確定方向的全因子實驗

為確定Co2+、Mo6+兩因子的搜索方向，進行22的全因子實驗，并增加5次在中心點的實驗作為曲面曲度的驗證。其它因子的濃度都固定在中心點。確定方向的全因子實驗的因子編碼與實際濃度見表4，結果見表5，方差分析見表6。

表4 確定方向的全因子實驗的因子編碼與實際濃度

表5 確定方向的全因子實驗結果

表6 確定方向的全因子實驗的方差分析

由表6可以看出，交互作用和二次項都不顯著，而線性非常顯著，彎曲的P值大于0.05，可以認為此設計并沒有位于彎曲的曲面上，并且Co2+、Mo6+對響應的影響有可加的效應。對數據進行規范變量的一階模型擬合，結果發現，該模型的相關性很好，失擬不顯著，故確定該模型能很好地擬合實驗數據。

擬合的一階模型為：Y(U·mL-1)=3175-61.5X3-71.25X4+8.7X3X4。

2.3 最速上升實驗

擬合的一階模型中Mo6+、Co2+的系數都是負的，因此要離開設計中心沿最速上升路徑移動，就要沿Co2+、Mo6+濃度減小的方向移動。設Mo6+的步長為λ1，由公式λ2=61.5λ1/71.25可求出Co2+的步長λ2。

最速上升實驗結果見表7。

表7 最速上升實驗結果

由表7可以看出，由原點向濃度減小的方向搜索時，從原點到(原點+5λ)實驗組效價逐漸升高，然后下降，認為最優點在(原點+3λ)～(原點+7λ)之間。因此，選擇1.5×10-5～3.5×10-5g·mL-1金屬離子進行中心組合設計。

2.4 中心組合設計

中心組合設計的因子編碼與實際濃度見表8。

表8 中心組合設計的因子編碼與實際濃度

表9是帶有4個軸向點、5個中心點的可旋轉的中心組合設計結果，方差分析見表10。

表9 中心組合設計結果

表10 中心組合設計的方差分析

由表10可以看出，模型的失擬P值大于0.05，所擬合的規范變量的二次多項式失擬很小，98.2%的數據可以用該模型來解釋。

中心組合設計響應面圖見圖1。

圖1 中心組合設計響應面圖

3 驗證實驗

由模型通過Minitab統計學軟件計算得到Mo6+、Co2+的最佳濃度為2.486×10-5g·mL-1，效價預測值為4947.31 U·mL-1。

對比添加金屬離子及未加金屬離子的搖瓶培養結果，如表11所示。

表11 金屬離子添加與否對萬古霉素效價的影響

由表11可知，添加金屬離子搖瓶培養72 h的萬古霉素平均效價達到4946 U·mL-1，較未加金屬離子提高了17%。

4 結論

利用25-1部分因子析因設計考察了所選的5種微量金屬離子對萬古霉素的影響，篩選出Mo6+、Co2+為主要的影響因子；然后通過最速上升實驗確定了Co2+、Mo6+的適宜濃度范圍；在此基礎上利用中心組合設計確定Co2+、Mo6+的最佳濃度為2.486×10-5g·mL-1，并對此結果進行了驗證。優化后東方擬無枝酸菌搖瓶培養72 h后的萬古霉素平均效價從4206 U·mL-1提高到4946 U·mL-1，提高了17%。

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