家蠶抗菌肽Cecropin D基因的原核表達、純化及抑菌活性測定

章玉萍 牛曉利 曹玉橋 范 濤 代君君 王儲言 吳傳華 劉 健

(1安徽省農業科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061; 2石藥集團河北中潤制藥有限公司，河北石家莊 050000)

家蠶病毒病、細菌病和真菌病等主要的傳染性蠶病遍及世界各蠶區。有些家蠶品種對某一種或幾種家蠶病毒具有抗性或不感受性。如菁松對家蠶濃核病病毒(BmDNV)敏感，菁松近等基因系表現為不感受性。通過利用抑制性消減雜交研究家蠶品系菁松和菁松近等基因系在添食家蠶濃核病病毒前后基因表達的變化，檢測到家蠶抗菌肽在添毒后表達水平增高［1］。抗菌肽是一類具有光譜抗細菌、病毒和真菌的較為保守的小分子蛋白［2－3］，多帶有正電荷，同時具有親水和疏水性2種特性?？咕淖鳛榧倚Q先天性免疫的效應分子，具有很好的抗菌活性，并對抑制BmNPV在家蠶體內增殖有一定作用［4］。我們通過構建抗菌肽Cecropin D重組表達載體，表達載體導入E.coli BL21宿主菌中，經異丙基β－D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，再通過谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione s2transferase，GST)親和層析純化出GST-Cecropin D融合蛋白，最后檢測其抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試家蠶品種:黃血蠶7019(Nistari)，由中國農業科學院蠶業研究所提供;菌株DH5α、TOP10和BL21，表達載體pET-41b，由中國科學院上海植物生理生態研究所昆蟲中心實驗室提供;T4DNA連接酶、限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，購自NEB公司;異丙基 β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal、Ex Taq DNA聚合酶，購自TaKaRa公司;蛋白質分子量標準、GST抗體，均購自上海生工生物公司;RNA提取試劑盒，購自上海英駿公司，其它常規試劑均為國產。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 CecF:5'-GGAATTCTGACG ACGACGACAAGGCTCCCGGCAACTTCTTC-3'，其 中GAATTC為EcoRⅠ酶切位點，GACGACGACGACAAG為腸激酶酶切位點(為了后期去除 GST標簽)。CecR:5'-GGCCTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGCTT TTG-3'，CTCGAG為XhoⅠ酶切位點。

1.2.2 總RNA提取和RT－PCR 參照RNA提取試劑盒說明提取5齡第3天家蠶幼蟲的總RNA，然后用家蠶總RNA為模板，按反轉錄酶的使用說明進行cDNA第1鏈的合成。以家蠶cDNA為模板，用引物對CecF/CecR進行PCR擴增，反應條件:94℃預變性3 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃30 s，共30個循環;最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 載體構建 PCR膠回收后，EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收酶切產物并連接到經同樣雙酶切的pET－41b載體上，轉化感受態DH5α，陽性克隆通過鑒定后送桑尼生物公司測序。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達及表達條件優化 將測序正確的載體pET-41b-CecD轉化到感受態大腸桿菌BL21中，挑單克隆接種于含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、250 r/min振蕩培養12 h，按1∶100的體積比，將培養的菌液接到新的含卡那霉素的LB培養基中，37℃培養至OD600為0.6～0.8，加入1 mmol/L異丙基β-D硫代半乳糖苷 (IPTG)于37℃誘導4 h，離心收集菌體，PBS重懸，冰浴下超聲波破碎菌體，離心收集上清和沉淀，10%SDSPAGE電泳分析。表達條件優化分2組進行，1組分別誘導1、3、4、6 h，取樣;另1 組分別以 IPTG 終濃度0.01、0.02、0.05、0.10、0.50 mmol/L 進行誘導，取樣。

1.2.5 蛋白質印跡(Western blot)鑒定融合蛋白IPTG誘導前后的菌液樣品經SDS-PAGE電泳，將凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，利用融合蛋白上的GST標簽，以抗GST抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG為二抗，進行Western blot分析。

1.2.6 重組蛋白的純化 大量誘導的細菌經超聲破碎后，離心，上清液用0.4 μm微孔濾膜過濾，利用GST親和層析法進行重組蛋白的純化［5］。

1.2.7 抗菌肽抑菌效果的測定 分別采用抑菌圈法［6］和測定細菌生長曲線的方法來檢測抗菌肽的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽Cecropin D基因克隆及pET-41b-CecD載體構建

從NCBI上下載家蠶抗菌肽Cecropin D基因的氨基酸序列，利用在線軟件(http:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測。前22氨基酸應該為信號肽。根據預測結果，在載體構建時去除信號肽。以家蠶5齡幼蟲 cDNA為模板，擴增Cecropin D基因，連接到pET-41b載體上，構建成重組載體pET-41b-CecD(圖1)。

圖1 Cecropin D PCR擴增及pET-41b-CecD載體雙酶切驗證

2.2 重組蛋白GST－Cecropin D的原核表達結果

SDS-PAGE電泳結果顯示，重組載體pET-41b-CecD導入E.coli BL21宿主菌中經IPTG誘導表達后，過表達的重組蛋白 GST-Cecropin D約為36.7 kDa(圖2)。IPTG誘導3 h重組蛋白表達量最大(圖2－A，泳道4)，誘導劑IPTG的濃度變化對蛋白表達量沒有顯著影響(圖2－B)。經超聲波破碎細菌并離心后，分別收集沉淀和裂解上清進行SDSPAGE電泳分析，結果在沉淀和上清中都檢測到了目的蛋白條帶(圖2－B，第9、11泳道)，說明該融合蛋白具有可溶性表達和形成包涵體2種形式(圖2－B，第8、10泳道分別是未誘導對照的沉淀和上清)。

2.3 Western blot分析

結果如圖3所示，重組質粒pET－41b－CecD轉化的BL21菌經IPTG誘導后，在36.7 kDa處出現與GST特異結合的條帶。IPTG誘導后過表達的產物為GST融合蛋白。

2.4 重組蛋白GST-Cecropin D純化及SDS-PAGE分析

大量培養菌液經超聲破碎細菌并離心后，收集上清用GST柱進行親和純化。SDS－PAGE電泳分析顯示，過GST柱后的濾出液中只含有少量的目的蛋白(圖4，泳道1)，而在洗脫液中分子量約為36.7 kDa位置處出現了一條清晰的蛋白帶(圖4，泳道2)，即為純化的目的蛋白。

圖2 重組蛋白GST-Cecropin D的SDS－PAGE分析

圖3 重組蛋白的Western blot分析

圖4 重組蛋白純化后SDS-PAGE分析

2.5 重組蛋白GST-Cecropin D抑菌活性測定

以大腸桿菌TOP10為指示菌株，采用平板抑菌圈法初步檢測重組蛋白GST-Cecropin D的抑菌活性。結果表明:重組蛋白GST-Cecropin D有明顯的抑菌活性(圖5)。GST親和純化的濾出液也有一定的抑菌活性，說明在濾出液中存在未被完全吸附的抗菌肽。

圖5 抑菌圈實驗

分別在1 mL LB培養基中加入10 μL濾出液(約0.1 mg/mL)、磷酸鹽緩沖液(0.01M)和重組抗菌肽(2.5 mg/mL)，卡那霉素(50 μg/mL)作為陽性對照，然后接菌1 μL(培養的TOP10菌株)，37℃，250 r/min搖培，間隔2 h取樣測OD600，檢測不同處理下細菌生長情況并繪制生長曲線。發現重組抗菌肽和卡那霉素一樣具有很好的抑菌效果，搖菌14 h，OD600仍然為0(圖6)。

圖6 不同處理條件下細菌生長曲線

3 討論

抗菌肽Cecropin D是一種陽離子小蛋白，作用機制是通過其兩親性α－螺旋上正電荷與細胞質膜磷脂分子上負電荷之間的靜電吸引而結合聚集在質膜上［7］，隨后疏水段C端α－螺旋插入到疏水的胞膜中央，打亂了質膜上蛋白質和脂質原有的排列秩序，導致膜去極化從而破壞質膜結構，并導致細菌和病毒死亡。由于家蠶Cecropin D是小分子多肽，對宿主有毒性，直接在E.coli中表達抗菌肽產量低，因此本研究以融合表達的方式，利用載體自帶的谷胱甘肽硫轉移酶蛋白實現了在E.coli中的高效可溶性表達，純化后的重組抗菌肽可以很好地抑制并殺滅細菌，其效果與抗生素卡那霉素相似。

BmDNV為裸露的小病毒，病毒核酸為單鏈脫氧核糖核酸，其寄生部位高度特異，只寄生家蠶中腸前部和后部的圓筒形細胞的細胞核［8］。家蠶感染BmDNV后中腸及圍食膜結構遭到破壞，消化管內的細菌可以透過圍食膜感染中腸，細菌細胞壁上的肽聚糖、脂多糖通過Toll pathway的信號識別蛋白引起抗菌肽高效表達［9－10］。

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