桑樹硬枝扦插生根過程中相關生理生化指標的動態分析

劉明魯 孫 磊，2 張曉峰 聶 浩 程嘉翎，2

(1江蘇科技大學，江蘇鎮江 212003; 2中國農業科學院蠶業研究所，江蘇鎮江 212018)

桑樹屬桑科桑屬植物，是我國重要的經濟樹種。扦插作為桑樹無性繁殖技術之一，不僅具有保持母株優良特性的優點，而且具有操作簡單易行、育苗周期短等特點。但由于桑樹枝條難以生根，扦插繁殖成活率低，因此制約了桑樹扦插繁殖技術的推廣應用。目前，曹邦華等［1］對桑樹硬枝扦插過程中插穗基部的過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的動態活性變化進行了研究，發現這3種酶活性的動態變化與生根過程密切相關，而對桑樹硬枝扦插過程中營養物質含量和抗氧化酶系統活性變化的分析鮮見報道，且都將插穗基部作為研究重點，并未將頂芽下皮部和插穗基部作為一個上下聯動的整體進行研究;為此我們將插穗基部皮層和頂芽下皮部(上部皮層)作為一個聯動系統，研究分析了插穗皮層的含水率、營養物質、滲透調節物質、氧化酶類的動態變化，并探討了這些因子對桑樹扦插生根的影響，以期為桑樹優良品種硬枝扦插繁育技術的改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 供試材料 桑品種:育71－1，選用1年生硬枝枝條的中下部剪制插穗，采自鎮江桑樹國家資源圃，樹齡4年。

1.1.2 主要試劑 愈創木酚、DTT，為 BBI分析純生化試劑，其余試劑均為國藥分析純。

1.1.3 主要儀器 超低溫冷凍儲藏箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)，LAB TECH紫外分光光度計(上海精密科學儀器廠)，雷磁PHS－2F型pH計(上海精宏實驗設備有限公司)，ROTANTA380R型冷凍離心機(Hettich ZENTRIFUGEN)。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑樹硬枝扦插及發育過程形態表征調查2011年2月底進行扦插，在鎮江桑樹國家資源圃中剪取育71－1硬枝插條，剪成17 cm長的插穗1200余根，頂芽距上切口1.5 cm。采用地加溫線溫床扦插方法，扦插前用消毒凈(中國農業科學院蠶業研究所附屬蠶藥廠生產)對溫床進行消毒，將焦糠充分吸水后置于溫床中，參照文獻［2］的技術處理插穗并扦插，溫度控制在28℃，相對濕度70% ～80%。扦插時插穗在溫床上部露出第1個芽，扦插后定期噴水。每隔3 d進行1次生根形態觀察;扦插21 d時隨機抽取50根插穗，調查扦插生根率、生根插條的平均生根數、根長，3次重復。

1.2.2 桑樹硬枝扦插生根過程中含水率、營養物質、滲透調節物質含量的測定 扦插的育71－1插穗，自扦插之日起，每隔3 d取20根插穗基部2 cm范圍內的皮層(基部皮層)、插穗頂芽下面2 cm范圍內的皮層(上部皮層)，分別剪碎后混合均勻，參照文獻［3］的方法進行插穗基部皮層、上部皮層的含水率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量的測定，參照文獻［4］的方法進行插穗基部皮層、上部皮層脯氨酸含量的測定。

1.2.3 扦插生根過程中抗氧化酶活性及生根關聯酶活性的測定 檢測樣品取樣同1.2.2的方法，每個檢測項目分別準確稱取0.5 g新鮮插穗基部皮層與上部皮層，用液氮研磨，加入磷酸緩沖液(PBS)5 mL，在冰浴中研磨成漿，11000 r/min離心20 min，取上清液冷藏備用，3次重復。

參照文獻［3］的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)和IAAO的活性，參照文獻［5］的方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性，參照文獻［4］的方法測定過氧化氫酶(CAT)、POD的活性，參照文獻［6］的方法測定PPO的活性。

SOD活性以抑制NBT光化還原率達50%的酶量為1個酶活單位，其結果以鮮質量為U/g表示;APX、CAT、POD以1 g插穗皮層鮮質量1 min改變0.01個OD值為1個酶活力單位(U/g);PPO以1 g插穗皮層鮮質量1 min改變0.1個OD值為1個酶活力單位(U/g);IAAO以1 g插穗皮層鮮質量在1 h內分解破壞吲哚乙酸(IAA)的質量(ug)為1個酶活力單位(U/g)。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel軟件和Origin軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 硬枝扦插生根情況及發育過程形態表征

育71－1桑樹硬枝插穗參照文獻［2］的技術處理誘導，扦插經過21 d時，插穗生根率達到87.8%，生根插穗的平均生根數為19.6根/株，平均根長為3.5 cm。

桑樹硬枝扦插生根形態學觀測發現，插穗扦插3 d后，絕大部分插穗的切口上木質部與韌皮部交界處的微管形成層產生了少量的愈傷組織突起，到第6天觀察到插穗切口及以上3 cm區段部位膨脹并伴有更多的突起;12 d后有大部分的插穗切口以上的皮部突起并伴隨皮孔伸出明顯的不定根尖，18 d后不定根伸長生長且有少量插穗產生2級側根;插穗上部皮層無明顯形態變化，插穗上的頂芽在第6天開始萌動，第18天已經抽生出新芽(圖1)。據此，桑樹硬枝扦插生根可大致分為4個時期:0～5 d為愈傷組織的誘導期，6～11 d為不定根生成誘導期，12～17 d為生根表達期，18～21 d為根的伸長期。

圖1 桑樹硬枝扦插過程中插穗基部與插穗頂芽形態表征變化

2.2 硬枝扦插過程中含水率的變化

桑樹硬枝扦插插穗經人工誘導后，插穗基部皮層的含水率穩步上升，在第12天時達到最大值，之后趨于穩定，上部皮層的含水率變化不大;在整個生根過程中，插穗基部皮層的含水率明顯高于上部皮層的含水率(圖2)。水分作為一個重要的條件，對于植物的生存起著決定性的作用;插穗基部從扦插基質中吸收水分以適應由離體插穗所造成的機械損傷和水分脅迫，而頂芽下皮部裸露在空氣中，處于室溫條件下，生理活性較低，含水率無明顯變化。

圖2 硬枝扦插過程中含水率的變化

2.3 硬枝扦插過程中營養物質含量和滲透調節物質含量的變化

桑樹硬枝扦插生根過程中，可溶性糖的含量總體呈下降趨勢，在0～3 d變化得尤為劇烈，說明愈傷組織的誘導形成消耗了大量的可溶性糖，插穗上部皮層的可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于插穗基部皮層，并且插穗上部皮層的可溶性蛋白含量變化也呈現出階梯式下降的趨勢，表明可溶性糖和可溶性蛋白由莖部向基部運輸，以滿足基部旺盛的代謝活動的需要。而插穗基部皮層的可溶性蛋白含量表現為先下降后上升再下降的趨勢，這是因為在愈傷組織和不定根誘導期(0～11 d)，大量消耗了可溶性蛋白以產生愈傷組織，導致蛋白質含量急劇下降;12～17 d愈傷組織膨大生長，并且部分插穗開始生根，可溶性蛋白稍有上升;18～21 d根系生長，插穗頂芽大部分已萌發，可溶性蛋白含量略有下降(圖3)。

圖3 硬枝扦插過程中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的變化

桑樹硬枝扦插過程中插穗基部皮層和插穗上部皮層的脯氨酸含量和可溶性糖含量變化趨勢相似，總體呈下降趨勢，在愈傷組織誘導初期(0～3 d)，插穗基部皮層的脯氨酸含量急劇下降，之后維持恒定水平;而插穗上部皮層的脯氨酸含量則呈現出階梯式下降的趨勢，表明插穗上部皮層水分、營養和滲透調節系統的變化不如插穗基部皮層的變化劇烈，更多的表現出一種階段性變化的趨勢。(圖3)

2.4 硬枝扦插過程中抗氧化酶類活性變化

植物細胞內存在清除氧自由基的酶促保護系統和非酶促保護系統，SOD、APX、CAT、POD是酶促保護系統中的重要成份。

2.4.1 SOD和APX活性變化 扦插過程中插穗上部皮層的SOD活性均高于插穗基部皮層;而插穗上部皮層的APX活性均低于插穗基部皮層(圖4－5)。SOD是氧自由基清除酶促防御系統中的重要成員，與植物抗氧化能力直接相關［7］;SOD活性也是衡量生根的重要指標［8］。桑樹硬枝扦插過程中的SOD活性和APX活性變化與扦插生根相關聯，其在生根過程中呈下降趨勢。硬枝扦插初期，經過人工誘導，離體插條基部通過吸收基質水分對抗機械損傷和水分脅迫，很快適應了環境，插條遭受氧自由基的危害較小，以后隨著不定根的長出和伸長，逐漸處于有利的生存狀態。

圖4 硬枝扦插過程中SOD活性變化

圖5 硬枝扦插過程中APX活性變化

2.4.2 CAT活性變化 CAT活性在插穗基部皮層表現出波浪式上升趨勢，而在插穗上部皮層則表現為先升高后下降再升高的趨勢(圖6)。O2－經過SOD的解毒作用生成H2O2，隨后存在于細胞質中的H2O2主要由2種胞質APX清除，而CAT則主要降解過氧化物酶體中的H2O2［9］。

圖6 硬枝扦插過程中CAT活性變化

2.5 硬枝扦插過程中生根關聯酶活性變化

2.5.1 POD活性動態變化 從圖7可以看出，插穗基部皮層POD活性呈先升高后下降再升高的趨勢，而在插穗上部皮層則表現出先略有上升后相對恒定的趨勢。POD通過催化H2O2與其他底物反應，以消除植物在逆境和衰老情況下產生的H2O2，而減少H2O2對生物體的傷害作用。POD不僅與植物抗逆和衰老有關，同時具有與植物生長素氧化酶相似的性質，對植物的生長有調節作用，參與細胞壁多種結構成分的聚合作用，因此POD活性對插條生根起著重要的作用。

圖7 硬枝扦插過程中POD活性變化

POD不僅是植物抗氧化酶系統的重要組成部分，而且在扦插生根過程中也發揮著重要的功能。Garspar等［10］將 POD作為植物插條生根的標志之一，植物POD是一類含鐵卟啉輔基的酶，參與了植物體內多種生理生化過程，POD在植物體內不僅參與了生長素的代謝活動，而且對植物形態的建成、生長分化也有一定的作用。POD活性在插穗生根的不同時期呈現出規律性變化。在整個扦插階段，插穗基部皮層的POD含量明顯高于插穗上部皮層;插穗基部皮層的POD活性在扦插后3 d上升，3～9 d穩定，9～12 d下降，12 d后持續上升;插穗上部皮層的POD活性在扦插過程中變化不明顯。在愈傷組織和不定根的誘導期(0～9 d)，POD活性上升，消耗體內過多的內源生長素，有利于誘導根原基發育;其后9～12 d，POD活性下降，導致體內IAA含量上升，有利于不定根的表達;12～21 d生根期間，此時POD活性穩步上升(圖7)，促進不定根的形成和根的伸長生長。

2.5.2 PPO活性變化 在桑樹硬枝扦插過程中，插穗基部皮層的PPO活性呈現先下降后上升的趨勢;在愈傷組織誘導期，PPO活性相繼下降，在不定根的誘導、表達和伸長期，PPO活性逐漸上升，說明愈傷組織的誘導需要低活性的PPO，而不定根的表達和伸長需要高活性的PPO，這與曹邦華等［1］的研究結論一致;而插穗上部皮層的PPO活性在12 d后呈明顯下降趨勢，15 d之后逐漸上升。插穗基部皮層的PPO活性總體上略高于上部皮層的PPO活性(圖8)。

圖8 硬枝扦插過程中PPO活性變化

PPO的存在對不定根的形成是十分重要的［11］。高等植物中普遍存在PPO，這是一種含銅的酶，不僅在植物的生長發育中起著重要作用，而且在植物的器官形態上也發揮著重要的功能。酚類物質對不定根的發生與發育起著極其重要的作用，PPO的一個重要生理功能就是催化酚類物質與IAA形成一種“IAA－酚酸復合物”［12］，這種復合物是一種生根輔助因子，具有促進不定根形成的活性［13］。在不定根的誘導期和根的表達和伸長期，PPO活性較高，因此，形成的IAA－酚酸復合物較多，有利于不定根的發育和不定根的誘導，促進不定根的形成和根的伸長生長。

2.5.3 IAAO活性變化 在扦插生根過程中，IAAO活性在插穗基部皮層0～5 d愈傷組織誘導期升高，在第6天時達到高峰，在根的誘導期急劇下降，在根的表達和伸長期保持較低水平。而插穗上部皮層的IAAO活性呈現出先上升后下降再上升的總趨勢，在12 d后持續小幅上升(圖9)。

圖9 硬枝扦插過程中IAAO活性變化

3 討論

3.1 硬枝扦插生根與含水率、營養物質和滲透調節物的關系

桑樹硬枝扦插過程中，插穗基部皮層的含水率先穩步升高后趨于穩定，上部皮層的含水率無明顯變化;可溶性糖、脯氨酸含量在扦插生根過程中呈下降趨勢，且在0～3 d表現得極為劇烈，之后趨于平穩，可溶性蛋白在插穗基部皮層表現為降—升—降的趨勢，在插穗上部皮層表現出差異的變化趨勢。營養物質不僅是插穗生根和生長所不可或缺的，而且也是插穗在生根之前維持其生存的重要能源。糖類物質是植物體內主要的營養儲藏和運輸形式，插穗生根與插穗內含糖量有關。脯氨酸是植物中廣泛存在的滲透調節物質，其作用是保持細胞與環境滲透平衡，防止水分散失，在水分脅迫時它能與細胞內的一些化合物形成聚合物，具有保水作用［14］?？扇苄缘鞍滓渤Ｗ鳛橹参锟鼓嫘灾笜?，主動參與水分脅迫時植物的滲透調節，是除脯氨酸、可溶性糖外，植物中重要的有機滲透調節物質［15］。這些生理活性物質在扦插生根過程中的營養供應和滲透調節中發揮著重要的功能。

3.2 硬枝扦插生根與抗氧化酶系統的關系

SOD與CAT、POD、APX協同作用，可防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統的傷害。在扦插過程中，SOD活性和APX活性總體上呈下降趨勢，而CAT活性和POD活性總體上呈上升趨勢，SOD、POD、CAT、APX的協同作用可以將植物體內的活性氧維持在較低的水平，以保證其正常的生長代謝。

3.3 硬枝扦插生根與生根關聯酶的關系

POD、PPO、IAAO是目前公認的與不定根關系最密切的3種酶類，它們不僅在植物的生長發育中起重要的作用，而且在植物的形態建成中也發揮著重要的功能。POD活性的高低可作為判定桑樹生根難易的指標之一。已有研究發現［16－17］，POD 活性在扦插生根過程中會出現2個高峰，分別參與根的誘導及表達，POD作用的某些產物可能是不定根發生和發展所必需的輔助因子。PPO的重要作用是催化酚類物質與IAA綜合形成一種生根輔助因子，即有利于生根的“IAA－酚酸復合物”。IAAO可以氧化IAA，IAA一個重要的生理功能就是促進不定根的形成，IAA含量的變化勢必影響不定根的發生;因此，IAAO活性的大小與根的發生有非常重要的關系。Wiesmann等［18］認為:在根的誘導期較低的IAAO活性有利于不定根的發育，從而促進不定根的生長;宋金耀等［16］和宋麗紅等［19］發現，在根的發生期IAAO活性下降有利于插穗IAA的積累以促進根的生長;在桑樹硬枝扦插生根過程中，3種氧化酶活性都呈現規律性的變化，與不定根的發生和發展關系非常密切，它們在生根過程中的作用可能是既獨立又聯系的，通過相互作用來影響生根。

3.4 硬枝扦插生根與插穗不同部位的關系

桑樹硬枝扦插時，焦糠一直埋到頂芽下，插穗基部與芽下皮部在扦插溫床中所處的溫度不同，插穗基部埋于加溫線正上方，為恒溫28℃，芽下皮部為室溫2～12℃，本試驗對第1芽下皮層的相關生理生化指標進行了測定，研究分析發現插穗下部皮層的可溶性糖、脯氨酸、APX活性的變化趨勢與插穗基部相似，而抗氧化酶系統在桑樹硬枝扦插過程中變化不大;表明扦插生根與插穗上部皮層的抗氧化酶系統關聯度不高;生根關聯酶中的IAAO和PPO活性在0～12 d與插穗基部皮層變化趨勢大致相同，12 d之后變化趨勢相反。12 d為不定根形成期，且頂芽已經萌動，插穗基部皮層和插穗上部皮層的差異變化可能與酚類物質和IAA的極性運輸有關。

本研究將桑樹硬枝扦插過程中插穗基部皮層和插穗上部皮層作為一個上下聯動的系統，進行了相關生理生化指標的測定，研究分析了營養物質、滲透調節物質和氧化酶類，在扦插過程中的變化及生根特性和酶活性變化之間的聯系，但對桑樹扦插生根機理的明確解析，還有待于進一步的研究?？梢钥紤]從插穗受傷后在特定條件下的信號傳導，利用抑制消減雜交技術(SSH)和蛋白質雙向電泳技術，對在扦插過程中成根基因的激活和表達進行更加深入的研究。

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