RP-HPLC法測定膽寧片中金絲桃苷的含量

黃媛平

(南昌市第三醫院 藥劑科,江西 南昌 330009)

膽寧片[1]由大黃、虎杖、青皮、陳皮、白茅根 、郁金、山楂七味藥組成,方中山楂具有開胃消食、化滯消積、活血散瘀、化痰行氣;山楂含有黃酮類、有機酸類、三萜酸類活性物質,近年來的藥理研究證明山楂黃酮對心血管系統等有多方面的藥理作用[2],金絲桃苷和蘆丁是山楂黃酮的代表成分,有關山楂單味藥金絲桃苷的含量測定的報道較多[3-4],但未見報道膽寧片中金絲桃苷含量測定的HPLC方法。為控制其內在質量,本研究中筆者建立了RP-HPLC法測定金絲桃苷含量的方法,本方法準確、精密、重現性好。

1 儀器與試藥

Agilent 1200液相色譜儀(美國),包括:四元梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱、G1314B VWD紫外檢測器;Sartorius BS124S千分之一電子分析天平和Sartorius BT25S十萬分之一電子分析天平;KQ-250VDB型雙頻數顯超聲機(昆山市超聲儀器有限公司),PHS-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

金絲桃苷(批號:111521-201004)購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜級),流動相用水為雙蒸水(自制);其余試劑均為分析純。膽寧片(市售),大黃(20100910)、虎杖(20090915)、青皮(20100713)、陳皮(20101014)、白茅根(20101205)、郁金(20090712)、山楂(20101116)。藥材均購自黃慶仁大藥房,由中藥鑒定教研室鑒定符合2010版《中國藥典》規定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱 Venusil XBP-C18柱(4.6mm ×250mm,5μ m);流動相為乙腈-0.05%甲酸水(三乙胺調節調pH至5.0),梯度洗脫(流動相梯度設置見表1);柱溫為25℃;檢測波長:358nm,進樣品量均為 20μ L。

表1 流動相梯度

2.2 混合對照品溶液的配制

取金絲桃苷對照品適量,精密稱定,置容量瓶中,加甲醇配制成1mL含132.62μ g金絲桃苷對照品溶液母液。

2.3 供試品溶液的制備

取膽寧片10片,除去包衣,60℃干燥恒重,粉碎磨成粉末,過100目篩。稱取約0.1g,精確稱定,置10mL容量瓶中,加 70%甲醇 7mL,超聲提取 45min。冷卻至室溫,用70%甲醇定容置刻度,搖勻,0.45μ m微孔濾膜濾過,即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按膽寧片處方比例和制備工藝分別制備不含山楂的膽寧片,并按供試品溶液的制備方法制備得到陰性對照溶液,按色譜條件測定,結果陰性對照樣品對測定無干擾,理論塔板數按金絲桃苷計不低于9000,見圖1。

圖1 對照品(S1)、供試品(S2)和缺山楂陰性樣品

2.5 測定方法

分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液,按上述色譜條件測定,采用外標法計算即得。

2.6 線性關系考察

分別準確吸取按“2.2”項下方法制備的混合對照品母液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL 置 1mL 容量瓶中,甲醇定容,搖勻,即得6種不同濃度的混合對照品溶液。分別吸取上述濃度對照品溶液20μ L,注入色譜儀,記錄色譜圖。以峰面積(Y)對濃度(X,μ g?mL-1)進行線性回歸,得回歸方程Y=17229X-9983,r=0.9996(n=6),線性范圍:13.26～132.62μ g?mL-1。

2.7 精密度試驗

精密吸取“2.6”項中間濃度梯度點的混合對照品溶液20μ L,重復進樣6次,按色譜條件測定峰面積值。求得金絲桃苷RSD值為0.96%。

2.8 穩定性試驗

取同一份供試品溶液,分別于 0 、2、4 、6、8 、10 、12h,按上述色譜條件測定峰面積。結果表明:供試品溶液在12h內,色譜峰面積無明顯變化,金絲桃苷RSD值為1.26%,說明供試品溶液在制備后至少12h內穩定。

2.9 重復性試驗

取同一批樣品6份(批號:20100404),按供試品溶液制備方法制備,依法測定,計算物質含量。結果金絲桃苷的平均含量分別為:7.36mg?g-1,其 RSD值為:1.43%。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品粉末6份,每份重約0.05g(含金絲桃苷7.45mg?g-1),精密稱定,置10mL容量瓶中,分別精密加入濃度為 371.5μ g?mL-1的金絲桃苷標準品溶液1.0mL,按供試品溶液制備方法制備,按色譜條件測定,計算平均回收率,結果金絲桃苷平均回收率為98.13%(n=6);RSD為1.41%。

2.11 樣品含量測定

取3批膽寧片樣品,按“2.3”項下方法制備樣品溶液,按色譜條件測定,采用外標法計算含量,結果見表2。

表2 膽寧片中金絲桃苷的含量測定結果 (n=3)

3 討論

金絲桃苷為黃酮醇苷類化合物,在260nm及360nm下有最大吸收,本實驗選擇358nm為檢測波長,以盡可能地排除膽寧片中其他雜質的干擾,得到的金絲桃苷色譜峰與其他雜質峰分離度良好。

為了盡可能將膽寧片中的金絲桃苷提取完全,本實驗對樣品前處理條件進行了考察,包括提取溶媒(水、50%甲醇、70%甲醇 、90%甲醇 、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇)和提取方法(超聲和回流),結果表明:以70%甲醇10mL,超聲提取30min可以將所取樣品中的金絲桃苷提取完全。

本實驗考察了各種比例以乙腈:水,甲醇:水,乙腈緩沖液和甲醇甲酸緩沖液洗脫系統,結果表明:乙腈-0.05%甲酸緩沖液(用三乙胺調pH至5.0),目標成分色譜峰于鄰近的峰能達到基線分離,峰形較好,理論塔板數高,分離效果最好。此外發現柱溫在25℃時比30℃的分離效果更好。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010:540.

[2] 鄭虎占,董澤宏,佘靖,等.中藥現代研究與應用[M].北京:學苑出版社,1997:597.

[3] 陳寶龍,黃琦,鄭朝華,等.高效液相色譜法測定山楂中金絲桃苷的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(3):24-26.

[4] 馬國,蔣學華,黃婷,等.HPLC同時測定山楂葉提取物中的5種主要成分[J].華西藥學雜志,2007,22(5):547-549.