蒺藜不同產(chǎn)地化學(xué)成分HPLC－模糊聚類(lèi)分析

張素軍

（臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

蒺藜（Tribulus terrestris L.）為蒺藜科 （Zygophyllaceae）一年生草本植物，分布于全國(guó)各地，其果實(shí)具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目止癢等功效［1］。作為傳統(tǒng)中藥，蒺藜有著悠久的臨床應(yīng)用歷史，并且全國(guó)通用。我國(guó)地域廣袤，地理環(huán)境和氣候條件相差很大，不同產(chǎn)地的蒺藜在發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)上是否具有地域差異性以及道地性，這方面的研究將為蒺藜資源的合理利用和臨床用藥提供理論指導(dǎo)。本文應(yīng)用中藥指紋圖譜技術(shù)中的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，對(duì)不同產(chǎn)地蒺藜的化學(xué)成分進(jìn)行模糊聚類(lèi)，以比較不同產(chǎn)地蒺藜在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)上的差異程度。

1 實(shí)驗(yàn)材料

蒺藜果實(shí)2009年8月中旬分別采自山東、河北、新疆、黑龍江、云南和福建，分別以SD、HB、XJ、HLJ、YN、FJ表示，經(jīng)臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副教授王文房鑒定，均為T(mén)ribulus terrestris L.的果實(shí)。取此果實(shí)，75%乙醇消毒3min、蒸餾水充分沖洗后，于55℃烘箱中烘干，機(jī)械粉碎后過(guò)45目篩，置干燥器內(nèi)備用。所用試劑除特別說(shuō)明外均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取蒺藜果實(shí)粉末5.0g，置具塞三角瓶中，加蒸餾水50mL，稱(chēng)重，室溫放置30min后，100℃水浴中提取60min，稱(chēng)重，用蒸餾水補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，4000r·min－1離心10min，上清用0.4μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2 色譜條件

KR 006C18色譜柱（250mm ×4.6mm ，5μm）；甲醇（A）－0.1%醋酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫如表1所示；柱溫為 30℃；流速為0.5mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；進(jìn)樣體積為10μL。所得色譜圖以山東樣品為例，見(jiàn)圖1。6個(gè)樣品的色譜峰以相對(duì)保留值進(jìn)行排列。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下制備山東樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，各共有色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明本方法具有較高的精密度。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下制備山東樣品溶液，分別于0h、4h、8h、12h和24h進(jìn)樣分析，各共有色譜峰的RSD均小于3%，表明樣品至少在24h內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖1 山東蒺藜果實(shí)的HLC色譜

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取山東樣品5份，按“2.1”項(xiàng)下制備樣品溶液，每份樣品進(jìn)樣1次，各共有色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重現(xiàn)性較好。

表1 HPLC流動(dòng)相變化梯度

2.4 模糊聚類(lèi)分析

2.4.1 原始數(shù)據(jù)的采集和處理

按“2.2”項(xiàng)獲取六個(gè)產(chǎn)地蒺藜果實(shí)的HPLC色譜圖，如圖1所示（以山東果實(shí)為例），選取保留時(shí)間為22.3min左右的共有色譜峰為內(nèi)參照峰，求出樣品中所有峰的相對(duì)保留值α（α＝各組分峰的保留時(shí)間／內(nèi)參照峰的保留時(shí)間）和相對(duì)峰面積RA＝某個(gè)峰的面積／內(nèi)參照峰面積，在相對(duì)保留值1%的范圍內(nèi)進(jìn)行共有峰排列，非共有峰的面積則以0記，如表2所示。以相對(duì)峰面積作為聚類(lèi)指標(biāo)。

2.4.2 模糊相似矩陣的建立

利用相關(guān)系數(shù)法對(duì)表5中的數(shù)據(jù)按公式

2.4.3 模糊等價(jià)矩陣的建立

根據(jù)平方法R→R2→R4→… 求模糊相似矩陣的傳遞閉包，即等價(jià)矩陣。由于R8＝R4，故R4為等價(jià)矩陣。

2.4.4 動(dòng)態(tài)聚類(lèi)

在0～1的范圍內(nèi)選取不同的置信水平λ值，求出等價(jià)矩陣的λ－截矩陣，從而在不同的λ水平上對(duì)對(duì)象進(jìn)行模糊動(dòng)態(tài)聚類(lèi)，分類(lèi)結(jié)果如下：

3 討論

模糊性是事物所具有的類(lèi)屬和性態(tài)的不確定性，是反映事物本質(zhì)的極為深刻的屬性［2］。模糊聚類(lèi)分析方法是對(duì)模糊性事物進(jìn)行分類(lèi)的方法，是對(duì)人腦模糊聚類(lèi)的一種數(shù)學(xué)模寫(xiě)。不同產(chǎn)地的同種植物在化學(xué)成分的種類(lèi)和含量上沒(méi)有截然分明的界限，而是具有一定的模糊性，適于采用模糊聚類(lèi)的方法進(jìn)行分析［3，4］。同時(shí)，我們采用HPLC色譜法對(duì)蒺藜的水提物進(jìn)行分析，得到的色譜峰的數(shù)目多，能夠基本上反映其物質(zhì)基礎(chǔ)的整體面貌。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用相關(guān)系數(shù)法對(duì)色譜峰進(jìn)行模糊相聚類(lèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.999的置信水平上，六個(gè)產(chǎn)地的蒺藜聚為同一類(lèi)，這是一個(gè)近乎為1.000的置信水平，這充分說(shuō)明六個(gè)產(chǎn)地的蒺藜在化學(xué)成分上的種類(lèi)和含量上可以說(shuō)是沒(méi)有差異的。盡管我們的樣品數(shù)目較少，但由于地域跨度大，我們有理由相信，國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的蒺藜在藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)上基本上沒(méi)有差異，這或許可以作為其可以通用而一直沒(méi)有提出道地性的一個(gè)佐證。當(dāng)然，我們的樣品采集時(shí)間基本相同，不同采收期的蒺藜其化學(xué)成分是否有差異以及差異如何，需做進(jìn)一步研究。

表2 不同產(chǎn)地蒺藜果實(shí)HPLC相對(duì)峰面積

［1］肖培根.新編中藥志［M］.第2卷.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：613－618.

［2］楊綸標(biāo)，高英儀.模糊數(shù)學(xué)原理及應(yīng)用［M］.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2002.

［3］趙蔡斌，周魯，付超，等.中藥復(fù)方的模糊分析［M］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9（2）：62－63.

［4］謝春英，賀巍，林敬明，等.中藥黃芩及其混偽品的模糊聚類(lèi)分析［J］.廣東微量元素科學(xué)，2000，7（12）：52－55.