紫杉醇、硒酸酯多糖序貫給藥對乳腺癌MCF－7細胞抑制作用的研究

陳春影，凌 娜，徐艷艷，季宇彬

（1.哈爾濱商業(yè)大學 生命科學與環(huán)境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）

乳腺癌現(xiàn)已成為我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康。開發(fā)對乳腺癌患者更合理、更有效的治療方法是我們關注的焦點［1］。近些年的研究表明，細胞增殖和凋亡的平衡決定著乳腺癌組織對放、化療及腫瘤藥物的反應性。因此，不同藥物對乳腺癌細胞生長抑制情況及藥物作用機制的深入研究，可為臨床上對乳腺癌的治療提供有效的依據(jù)［2］。紫杉醇（paclitaxel，Taxol）是一種促進細胞微管聚合、抑制微管解聚的新型抗腫瘤藥。目前臨床上已被用于治療卵巢癌、肺癌和乳腺癌［3］。硒酸酯多糖又稱硒化卡拉膠（k－selenocarrageenan，KSC），研究發(fā)現(xiàn)KSC在體內(nèi)外具有顯著的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用。可抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、增強免疫功能，并且能降低化療藥物的毒副作用［4］。本實驗采用MTT法、SRB法及流式細胞儀體外觀察Taxol與KSC聯(lián)合給藥對乳腺癌MCF－7細胞生長的抑制作用，并探討兩者聯(lián)合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：乳腺癌 MCF－7；試劑：RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO BRL生產(chǎn)），胎牛血清（杭州四季青），硒酸酯多糖（上海天賜福生物工程有限公司，含硒量1.68%），紫杉醇（成都天源天然產(chǎn)物有限公司），噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、磺酰羅丹明B（SRB）均為sigma公司產(chǎn)品。儀器：酶標儀（美國Bio－Rad公司），CO2培養(yǎng)箱（美國NBS公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），流式細胞儀（美國BECKMAN－COULTER公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），分析電子天平（Sartorius），TDL80－2B低速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

腫瘤細胞培養(yǎng)于RPMI－1640培養(yǎng)基中，含10%新生胎牛血清（56℃、滅活 30min）青霉素 100IU／mL，鏈霉素100U／mL。在孵化箱傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測 KSC、Taxol序貫給藥對乳腺癌MCF－7細胞抑制作用

用胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整濃度至2×104個／mL細胞懸液，按2000個／孔接種于96孔板中。24h后加入不同濃度的藥物，KSC（30mg／L）、Taxol（0.5、1、2、4nmol／L），同時給藥組（30mg／L KSC＋各濃度Taxol）、序貫給藥組1（先30mg／L KSC－24h后＋各濃度Taxol）、序貫給藥組2（先各濃度Taxol－24h后＋30mg／L KSC）。給藥時間為48h、72h后，每孔加100μL的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加 DMSO 150μL，微量振蕩器搖勻，用酶標儀在參考波長490nm，檢測波長570nm條件下測定OD，用如下公式計算藥物對腫瘤細胞的抑制率，并計算IC50。

抑制率（%）＝（對照組平均OD值－加藥組平均OD值）／對照組平均OD值×100%

1.2.3 SRB法檢測 KSC、Taxol序貫給藥對乳腺癌MCF－7細胞抑制作用

用胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整濃度至2×104個／mL的細胞懸液，接種于96孔板中。24h后加入不同濃度的藥物，給藥濃度同上。培養(yǎng)48h、72h。棄上清液，加50%三氯乙酸（TCA）液，4℃固定lh，棄固定液，用雙蒸水洗5遍，干燥后加4mg／mL SRB染液，室溫放置30min；棄染液用l%醋酸洗5遍，室溫干燥，加10mmoL／L的Tris緩沖液，10min后測OD值，計算細胞50%生長抑制所需的藥物質(zhì)量濃度（GI50），細胞完全生長抑制所需的質(zhì)量濃度（TGI），殺死50%細胞所需的藥物質(zhì)量濃度（LG50）。

1.2.4 流式細胞儀檢測MCF－7細胞周期及細胞凋亡率

對數(shù)生長期的細胞消化后，調(diào)整濃度至3×105個／mL的細胞懸液，接種于6孔板。24h后加入不同濃度的藥物，Taxol（0.5nmol／L），KSC（30mg／L），0.5nmol／L Taxol＋30 mg／L KSC，先30mg／L KSC－24h后＋0.5nmol／L Taxol，0.5nmol／L Taxol－24h后＋30mg／L KSC培養(yǎng)48h。胰酶消化，PBS洗滌后，加入70%冰乙醇固定。檢測前PBS沖洗細胞，調(diào)整細胞濃度為106／mL，加入800μL PI染色液（終濃度為50mg／L），混勻，室溫避光染色30min，300目尼龍網(wǎng)過濾后流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm測定細胞周期和凋亡率。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測KSC、Taxol序貫給藥對乳腺癌MCF－7細胞增殖影響

KSC、Taxol單獨可明顯抑制乳腺癌MCF－7細胞生長，其抑制率隨藥物濃度、作用時間增加而升高，具有時間和劑量依賴性，與對照組相比差異顯著（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組與對應濃度的單一用藥組相比，對MCF－7細胞作用更加顯著，聯(lián)合作用于 MCF－7細胞72h的IC50值是0.2561 nmol／L，遠小于 Taxol單獨作用濃度（1.7734nmol／L）。序貫給藥組與對應濃度單一用藥組相比，對MCF－7的抑制作用明顯。序貫給藥組2（先Taxol后KSC）優(yōu)于序貫給藥組1（先KSC后Taxol），同時用藥組顯著優(yōu)于序貫給藥作用效果（見圖1、2）。

圖1 MTT法檢測Taxol作用48h對MCF－7細胞增殖影響

圖2 MTT法檢測Taxol作用72h對MCF－7細胞增殖影響

實驗結(jié)果顯示，30mg／L KSC與0.5～2nmol／L Taxol同時應用表現(xiàn)協(xié)同作用（q＞1.15），與4nmol／L Taxol表現(xiàn)為相加作用（q＝0.85～1.15）。序貫給藥組1（先給KSC后給Taxol）表現(xiàn)是拮抗作用（q＜0.85），序貫給藥組2（先給Taxol后給KSC）表現(xiàn)是相加作用（q＝0.85～1.15）（見表1）。

表1 30mg／L KSC與Taxol聯(lián)合作用q值

2.2 SRB法檢測KSC、Taxol序貫給藥對乳腺癌 MCF－7細胞增殖影響

SRB法檢測KSC、Taxol單獨及聯(lián)合作用48h對乳腺癌 MCF－7細胞的GI50、LG50、TGI值結(jié)果如表2。

表2 KSC、Taxol序貫給藥對MCF－7細胞生長的影響（SRB）

2.3 流式細胞儀檢測KSC、Taxol序貫給藥對MCF－7細胞周期及凋亡率影響

FCM結(jié)果顯示，藥物對 MCF－7細胞作用48h，與空白組相比，Taxol作用組G1期細胞比例增多，S和G2／M期細胞減少；KSC作用組G1期細胞比例減少，G2／M期略有上升，S期增加；聯(lián)合給藥組較單獨給藥效果更明顯，G1期比例明顯下降，G2／M期和S期細胞明顯增加，表明Taxol使MCF－7細胞阻滯在G1期，KSC阻滯在S期，聯(lián)合給藥組使細胞阻滯在G2／M期和S期（圖3）。KSC與Taxol單獨及聯(lián)合作用對MCF－7細胞均有凋亡現(xiàn)象，聯(lián)合給藥組凋亡率小于Taxol單獨給藥組。

圖3 KSC、Taxol序貫給藥對 MCF－7細胞周期及凋亡率的影響

3 討論

硒酸酯多糖是一種新型有機硒化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和降低化療藥物毒副作用等多重生物功效，可誘導人乳腺癌、白血病、肝癌等多種腫瘤細胞凋亡。賴洵等［5］發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組殺傷力高于單用藥組且聯(lián)合用藥的凋亡峰高于單用藥物。李新莉等［6］發(fā)現(xiàn)紫杉醇單獨及與VC聯(lián)合均抑制MCF－7生長，將細胞阻滯在G2／M期及誘導細胞凋亡，給藥順序影響藥物作用效果。凌娜等［7］發(fā)現(xiàn)KSC與Taxol均能抑制HepG2細胞增殖，具有時效－量效關系，聯(lián)合組效果優(yōu)于單一用藥組。流式細胞術顯示兩藥均作用于S期，聯(lián)合組既可在S期發(fā)生周期阻滯現(xiàn)象，又可誘導凋亡。Shashi Mehta等［8］發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合使細胞阻滯于G2／M和S期。

本研究結(jié)果顯示KSC與Taxol同時給藥效果更佳。KSC與Taxol同時合用時，既可產(chǎn)生協(xié)同效果，又可避免大劑量Taxol對病人產(chǎn)生毒副作用，提高對化療藥物耐受性。序貫給藥組1（先KSC后Taxol）表現(xiàn)序貫拮抗效應，原因可能由于先加入KSC抑制細胞增殖，使細胞處于非增殖狀態(tài)，而非增殖期細胞對Taxol較耐受引起的。序貫給藥2（先Taxol后KSC）可產(chǎn)生相加作用，原因可能是Taxol主要阻斷細胞從G0－G1期向S期轉(zhuǎn)化，而S期細胞則為KSC敏感殺傷時期之一，這樣KSC就可有效地殺傷那些僥幸逃過了G0－G1期Taxol對其產(chǎn)生殺傷作用而進入S期細胞。在G0－G1和S期兩期同時對細胞產(chǎn)生殺傷作用，由此產(chǎn)生序貫相加。流式細胞儀分析單一及聯(lián)合給藥對MCF－7細胞周期及凋亡率的影響，結(jié)果表明Taxol單獨作用與對照組相比0.5～2nmol／L對 MCF－7作用在G1期，4～8nmol／L作用在G2／M和S期。Taxol與KSC聯(lián)合給藥對 MCF－7細胞表現(xiàn)為作用在G2／M和S期，既出現(xiàn)凋亡峰又出現(xiàn)G2／M和S期周期阻滯現(xiàn)象，同時給藥組凋亡率高于序貫給藥組，Taxol單獨給藥組凋亡率高于聯(lián)合給藥組，兩藥具有協(xié)同作用。因此，Taxol與KSC兩藥共同作用產(chǎn)生協(xié)同效應，提示了臨床應用的可能性，同時聯(lián)合作用的時間和順序也是臨床醫(yī)生必需考慮和注意的問題。

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