神經束植入治療家兔腓腸肌失神經支配的療效評價

楊延軍， 邱偉婷， 黃 剛， 陳 飛， 馬立峰， 張子清

(廣東省深圳市龍崗中心醫院， 廣東 深圳 518116)

周圍神經損傷在臨床上極為常見。盡管周圍神經修復技術已有了長足的進步，但即使是新鮮、清潔的周圍神經斷裂傷，及時采用先進的顯微外科技術進行修復，通常也不可能獲得完全再生，功能也往往不能完全恢復;而長時間的感覺或運動的缺失將引起肌肉萎縮、關節攣縮畸形等［1］。因此，如何促進周圍神經損傷的再生，最大限度地恢復其功能，一直是神經修復的基礎和臨床研究的熱點。其中神經修復的顯微外科手術包括：神經松解術、神經縫合術、神經移植術、神經移位術和神經束植入骨骼肌術等［1，2］。本研究擬對家兔失神經支配腓腸肌神經束植入后其肌濕質量、肌肉收縮能力的變化以及乙酰膽堿酯酶含量的變化進行連續觀察，為臨床尋找檢測肌肉萎縮程度方法和評價神經束植入術的療效。

1 材料與方法

1.1 失神經支配腓腸肌神經束植入動物模型的制作：家兔48只(廣東省實驗動物中心)，體重2.5 0.5kg/只，不拘雌雄，隨機分為3組，神經植入組、神經吻合組及對照組，每組16只。動物麻醉后，在放大10倍手術顯微鏡下，實驗組于右側梨狀肌下緣尋找坐骨神經，沿坐骨神經尋找其脛神經分支，將其進入腓腸肌的分支干進入肌肉表面切斷，然后將按神經束神經干分割成數支。神經植入組用10－0號顯微縫合線根據肌內神經的分布情況選擇性植入分別植入腓腸肌肌肉組織內;神經吻合組對坐骨神經發出支配腓腸肌分支后約1cm切斷，用10－0號顯微縫合線進行端－端吻合;對照組則于神經切斷后并切除進入腓腸肌分支1－2mm，阻止神經的自然生長。分別于術后 2、4、6、8、12、16、20 及 24周處死取兩組右小腿腓腸肌作實驗觀察。

1.2 肌肉濕重測定：將各時期處死家兔自股骨內外髁起點至跟骨結節止點完整取下腓腸肌，20℃用萬分之一天平稱其體重。

1.3 肌肉收縮功能的測定：家兔麻醉后，固定、游離右側腓腸肌，保留血供，切斷腓腸肌遠端肌腿并用絲線將肌腿直接與肌肉張力換能器水平相連，肌肉周圍不斷滴注37℃溫鹽水，局部烤燈保濕，用特制細銅絲雙極電極距入肌點2mm處直接刺激支配神經，刺激頻率為1Hz和40Hz，波寬20ms，作張力－長度曲線，記錄到最合適收縮長度后，分別記錄肌肉單收縮力和最大強直收縮力。

1.4 乙酰膽堿酯酶染色觀察：將各時期動物取材標本解剖顯微鏡下分離出肌束，行膽堿酯酶染色4℃下60min(染色孵育液配制：0.1moL順丁烯二酸溶液(pH6.0)6.5mL內依次加入碘化乙酰硫代膽堿5mg，0.1moL枸櫞酸鈉溶液0.5mL，20nmoL硫酸銅溶液1.5mL，蒸餾水2mL，5nmoL鐵氰化鉀溶液1mL，蔗糖1g)染色后直接壓片光學顯微鏡下觀察，應用計算機圖像分析系統，對各組取材乙酰膽堿酯酶含量進行測定，每個實驗動物取3張切片，400倍光鏡下隨機選取20個運動終板，檢測乙酰膽堿酯酶染色的縱斷面光鏡切片酶的灰度值(酶含量的灰度值為實際含量的倒數，數值越小，含量越高)。

1.5 統計學處理：實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件，進行統計學分析，結果用s表示，兩組間比較用t檢驗。

2 結果

術后不同時間點不同組間肌濕質量結果見表1，隨著時間延長，神經植入組間肌濕質量逐漸增加，神經吻合組肌濕質量呈緩慢上升趨勢。對照組肌濕質量呈緩慢下降趨勢。神經植入組在第12周時肌濕質量開始大于神經吻合組(P＞0.05)。術后不同時間點不同組間單肌收縮力的變化見表2，隨著時間延長，神經植入組單肌收縮力逐漸增加，到16周時，神經植入組與對照組單肌收縮力已經沒有差別。術后不同時間點不同組間肌肉收縮力的變化見表3，隨著時間的延長，神經植入組單肌收縮力明顯增加。術后不同時間點不同組間乙酰膽堿酯酶含量的變化見表4，在16周前，膽堿酯酶含量的變化不是很明顯，16周后，植入組膽堿酯酶含量明顯增加。

表1 術后不同時間點不同組間肌濕質量變化分析(s，n=16)

表1 術后不同時間點不同組間肌濕質量變化分析(s，n=16)

注：與對照組相比，＊＊P ＜0.01，＊P ＜0.05;神經植入組與神經吻合組相比，##P ＜0.01，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經植入組 1.275 0.064＊ 1.280 0.057＊ 1.280 0.042＊ 1.303 0.023＊ 1.335 0.007＊#1.405 0.007＊＊#1.515 0.035＊＊#1.770 0.014＊＊##神經吻合組 1.180 0.050 1.165 0.064 1.180 0.071 1.220 0.028 1.220 0.014＊ 1.230 0.014＊＊ 1.240 0.141 1.310 0.014＊對照組 0.975 0.035 0.940 0.014 0.925 0.007 0.915 0.007 0.905 0.007 0.895 0.007 0.895 0.021 0.8800.014

表2 術后不同時間點不同組間肌肉單收縮力的變化(s，n=16)

表2 術后不同時間點不同組間肌肉單收縮力的變化(s，n=16)

注：與對照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經植入組與神經吻合組相比，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經植入組 44.5 0.7# 51.0 1.4# 54.5 0.7＊# 61.0 1.4＊# 65.5 0.7＊＊# 71.0 1.7＊＊ 71.0 3.4＊＊ 79.0 1.4＊＊神經吻合組 67.5 0.7＊ 70.0 2.8＊ 72.5 1.7＊＊ 74.0 1.4＊＊ 75.5 2.7＊＊ 75.5 3.7＊＊ 75.5 1.7＊＊ 75.5 0.7＊＊對照組 41.5 2.1 46.5 0.7 48.5 0.7 50.5 0.7 47.5 0.7 45.5 0.7 45.5 0.7 44.70.6

3 討論

周圍神經損傷后骨骼肌萎縮及運動終板退變的防治一直是周圍神經外科研究領域的難題。骨骼肌及運動終板的狀態決定著神經功能的恢復情況。

Sunderland［3］發現肌細胞正常形態結構維持需靠一些神經營養因子的作用，失神經支配后最大變化是這些神經營養因子丟失導致的肌肉形態結構、生理生化及新陳代謝等方面改變。而失神經支配肌肉在形態學上首先表現為肌細胞漿丟失及直徑減少。骨骼肌失神經支配后組織形態學改變：周圍神經損傷后，骨骼肌因失去神經營養及廢用而發生萎縮。隨著失神經營養時間的延長，這種萎縮會逐漸加重，其質量也會較前逐漸減輕，腓腸肌肌濕質量恢復率的高低取決于該肌重獲坐骨神經再生纖維支配的間隔時間的長短和能與其運動終板有效連接的再生神經纖維的多少，所以腓腸肌(濕質量)恢復率可作為衡量坐骨神經再生效果的一項重要指標。在本研究中，神經植入組腓腸肌肌濕質量在手術后第2周就明顯重于對照組(P＜0.05)，且隨著時間延長，神經植入組腓腸肌肌濕質量增重明顯，這種差異愈發明顯。神經吻合組肌濕質量呈緩慢上升趨勢，在12周時，與神經植入組比較，差異開始具有統計學意義，神經植入組重于吻合組(P＜0.05)。從而表明神經植入對神經功能的恢復及神經再生的效果優于神經吻合。而對照組因失神經支配后，骨骼肌因失去神經營養及費用而發生萎縮，所以質量較前逐漸減輕。

神經植入組與吻合組肌肉單肌收縮力與強直收縮力在術后均不斷增強，但植入組增加更快，這說明神經植入能明顯改善肌肉的收縮性能。

在正常生理狀態下，運動神經元通過運動終板與骨骼肌纖維建立聯系，支配骨骼肌完成各種生理功能。神經損傷后，近端軸突逆行潰編，神經元受損乃至死亡;遠端軸突及運動終板發生變形改變。骨骼肌纖維也因失去了神經營養而發生變形以及酶活性和分布的改變。遠端軸突發生waller變形，導致運動終板乙酰膽堿酯酶活性下降。

神經再生時，運動終板乙酰膽堿酯酶活性恢復正常。乙酰膽堿酯酶主要來源于運動神經元胞體，通過軸突快速運輸到達神經終末，乙酰膽堿酯酶活性的強弱反映運動神經元的功能狀態［4］。終板區乙酰膽堿酯酶含量多少亦可能反映終板退變及再生情況［5］。在本研究中，神經植入組及吻合組乙酰膽堿酯酶均呈上升趨勢，在第20周時，植入組乙酰膽堿酯酶含量明顯高于對照組(P＜0.05)。而對照乙酰膽堿酯酶含量變化不明顯。乙酰膽堿酯酶對乙酰膽堿有特異性水解作用，主要分布于運動終板處的突觸前膜及后膜，神經發放的沖動通過運動終板將乙酰膽堿傳遞給肌肉，從而引起肌肉收縮。終板區乙酰膽堿酯酶含量的多少能夠反映出運動神經元的功能狀態和運動終板退變和再生的情況［6］。本實驗中，神經植入組在術后16周前，膽堿酯酶含量沒有明顯變化，16周后明顯升高，Hu等認為運動終板和膠原纖維的消失是影響去神經支配晚期療效的主要因素，從而表明神經植入晚期療效明顯。

表3 術后不同時間點不同組間肌肉強直收縮力的變化(s，n=16)

表3 術后不同時間點不同組間肌肉強直收縮力的變化(s，n=16)

注：與對照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經植入組與神經吻合組相比，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經植入組 241.5 2.12#＊＊ 252.2 1.45#＊＊ 270.5 2.76＊＊#341.0 1.45＊＊＊#445.5 10.7＊＊ 471.0 11.4＊＊ 481.0 12.6＊＊ 479.0 16.4＊＊神經吻合組 427.0 31.11＊＊ 429.0 12.87＊＊ 432.5 12.77＊＊ 434.0 1.4＊＊ 455.5 0.7＊＊ 475.5 10.7＊＊ 475.5 10.7＊＊ 478.5 20.7＊＊對照組 150.5 7.77 146.5 6.74 148.5 7.78 146.5 6.74 137.5 6.32 135.5 8.76 125.5 8.77 124.69.65

表4 術后不同時間點不同組間乙酰膽堿酯酶活性含量的變化(s，n=16)

表4 術后不同時間點不同組間乙酰膽堿酯酶活性含量的變化(s，n=16)

所測數據為酶含量的灰度值－實際含量的倒數，數值越小，含量越高注：與對照組相比，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05;神經植入組與神經吻合組相比，#P ＜0.05

組別時間(周)2 4 6 8 1216 20 24神經植入組 121.5 12.12 122.2 11.45 130.5 12.76 141.0 11.45 145.5 10.7 171.0 11.4＊ 281.0 12.6＊＊#289.0 16.4＊＊#神經吻合組 127.0 31.11 129.0 12.87＊＊ 132.5 12.77＊＊ 134.0 11.4 155.5 20.7 175.5 30.7＊ 175.5 20.7＊ 178.5 10.7＊對照組 120.5 17.77 126.5 16.74 128.5 17.78 146.5 6.74 137.5 16.32 135.5 18.76 125.5 18.76 129.619.65

［1］Siemionow，M.and A.Sari.A contemporary overview of peripheral nerve research from the Cleveland clinic microsurgery laboratory［J］.Neurol Res，2004，26(2)：218 －225.

［2］Myckatyn，T.M.and S.E.Mackinnon.A review of research endeavors to optimize peripheral nerve reconstruction［J］.Neurol Res，2004.26(2)：124 －138.

［3］Sunderland S.Factors influencing the development and se-verity of the changes in denervated muscle.In：Nerve injury and repair［M］.Churchill living － stone，London，1991.247－257.

［4］殷琦，陸裕樸，褚曉朝，等.晚期周圍神經損傷治療臨床及實驗研究［J］.中華骨科雜志，1995，15(9)：596 －599.

［5］許小珊，沈菊英.運動終板及其神經末梢的染色方法［J］.中國人民解放軍軍事醫學科學院院刊，1980，9：105.

［6］殷琪，陸裕樸，胡蘊玉，等.肌肉失神經支配后運動終板早晚期退變實驗研究［J］.中國修復重建外科雜志，1995，9(1)：16 －8.