慢性牙周炎患者和健康者非刺激性全唾液中的差異蛋白比較

武影 束蓉 劉宏偉

（1.同濟大學附屬口腔醫院 牙周科，上海 200072；2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 牙周科，上海 200011）

唾液是人體的一面鏡子，許多疾病都可以在唾液中找到相關的蛋白分子標記物，如舍格倫綜合征、類風濕病、高血壓、糖尿病等。盡管利用唾液檢測診斷全身性疾病有較大發展但應用于口腔疾病的研究還很少，而且主要用于口腔癌的早期診斷和預后判斷[1]。目前已有涉及牙周病的唾液蛋白組學研究[2-3]。

眾所周知，慢性牙周炎是與全身性疾病密切相關的多因素疾病，其發病機制尚不清楚。利用慢性牙周炎患者和健康對照者的非刺激性全唾液（whole unstimulated saliva，WUS），通過蛋白組學方法，即雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）結合基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜檢測二者唾液中的差異，并對差異蛋白質點進行鑒定，為今后揭示慢性牙周炎的機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

根據1999年美國牙周病分類國際研討會提出的慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）的診斷標準[4]，從上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院牙周科就診的患者中隨機選取5例CP患者。同時選取5例健康對照者，牙齦探診出血的位點＜10%，探診深度＜3mm，附著喪失＞2mm的位點不超過1%，X線片顯示無牙槽骨吸收。各組均有3名男性，2名女性；CP組和對照組平均年齡分別為46、42歲。2組共同納入標準：全身無系統性疾病；婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內未做過牙周基礎治療；最近3個月未服用過抗生素；全口無齲者；無抽煙者。

1.2 WUS的采集和處理

按照Rhodus改良的方法采集WUS[5]。每人平均采集1.2mL唾液，采集后立即加入蛋白酶抑制劑（Sigma公司，美國，每毫升唾液加入100μL）。將所得樣本在4℃條件下離心，先1 300 g，5min，去除食物殘屑等；然后20 000 g，30min，徹底去除殘余細胞。最后各取其上清500μL，-80℃保存待用。待收集完所有的樣本后，合并組內各樣品，分別放入超濾管離心以進行樣品超濃縮。依照Bradford法，通過測定光密度值大小并對照標準蛋白的光密度值計算蛋白濃度，從而進行蛋白定量[6]。

1.3 2-DE

取上樣量100μg，等電聚焦為pH3～10非線性膠條（30V 12 h，500V 1 h，1 000V 1 h，8 000V 8 h；Amersham公司，美國），十二烷基硫酸鈉-聚炳烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）為12.5%的膠。經銀染顯色的凝膠通過GS-710光密度掃描儀獲取圖像，使用Imagemaster分析軟件（GE healthcare公司，美國）進行分析，統計3次重復實驗的2-DE圖譜（CP組和對照組各3次），得到合乎統計學標準的蛋白質差異點。蛋白質斑點的量被定義為構成這個點所有象素點強度值的總和，當一種蛋白質在2組樣品之間量變倍數大于1.5倍時認為這個蛋白在二者之間有顯著性差異。

1.4 基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜儀進行肽質量指紋分析

切取膠上的蛋白差異點并用胰酶酶解20 h，抽提酶解肽段，經Zip Tip脫鹽后樣品溶于0.1%三氟乙酸，然后基質與樣品1∶1體積混合，取1μL加到不銹鋼樣品靶上，在空氣中放置10min，待溶劑揮發干后將樣品靶送入儀器。利用Flex Analysis分析軟件將肽質量指紋分析（peptide mass fingerprinting，PMF）數據和MS-MS數據結合，將結合數據集提交到MASCOT（免費蛋白數據庫檢索程序）進行蛋白鑒定。搜索NCBInr數據庫，搜索的參數：肽片段相對分子質量最大容許誤差控制在±10-4，肽電荷為+1，酶解片段不完全選擇為1個。根據蛋白質得分與蛋白質數據庫查詢蛋白質的匹配和序列覆蓋情況，其中Mascot得分示意圖：X軸為Mascot得分，Y軸為匹配的個數，得分超出陰影區表示得到陽性鑒定（P＜0.05）。

2 結果

通過ImageMaster軟件對2組樣品2-DE膠上的點進行對比分析，發現2組之間存在著差異點（組間差異倍數≥1.5），得到17個差異點（圖1）。

而這些點經過以上串聯質譜儀結合數據庫搜索進行鑒定，可明確其中的13個點的蛋白質類型，包括一些未命名蛋白和假設蛋白（表1），其中737、725、692、986為同一種蛋白，716、535為相同蛋白。剩下的蛋白未能從數據庫中得到結果，提示可能為未知蛋白。這些差異蛋白在CP組的唾液中表達均增加，其中包括血清白蛋白（serum albumin）、β-纖維蛋白（βfibrin）、重組N-葉apo型人血清轉鐵蛋白2型晶體B鏈（chain B，human serum transferrin，recombinant N-terminal lobe，Apo form，crystal form 2）、免疫球蛋白α-1鏈C區（Ig alpha-1 chain C region）、 人血清白蛋白GA復合物（the GA module complexed with human serum albumin，HBA-GA）、Rca-Rhogdi復合物的B鏈（chain B，crystal structure of a Rca-Rhogdi complexes）、PRO2044、未命名蛋白、理論蛋白。

表1 CP組和對照組間的唾液差異表達蛋白Tab 1 Differentially expressed proteins in saliva between control group and CP group

3 討論

本實驗結果發現血清白蛋白在CP患者WUS中的表達是上調的，這與以往的研究報道患者全唾液中白蛋白含量顯著升高的結論一致[7-8]。因為全唾液中含有10%來源的齦溝液成分，在牙周組織炎癥狀態下齦溝液流量增大，進入唾液的成分也可能增高，其中包括血液中高豐度的白蛋白，同時這些蛋白也可經炎性牙齦組織直接滲出。血清白蛋白在唾液中的升高反映了牙周炎的嚴重程度和活動性，可作為CP患者唾液中的分子標記物。實驗還發現免疫球蛋白與對照組相比，CP患者全唾液中的IgA1上調，原因同上述解釋一樣，IgA1主要來自血液滲出，而且有研究表明糖尿病患者的IgA是升高的[9-10]。在CP組和對照組的差異蛋白比較中發現HBA-GA復合物，GA是厭氧性消化鏈球菌屬來源的白蛋白結合蛋白分子結構上的一個模塊，可以和宿主的血清白蛋白結合，形成HBA-GA復合物，有利于細菌的生長，也可增強細菌的毒力[11-12]。雖然GA的生物學功能還不十分清楚，但從其結構上可以解釋細菌適應性這個問題。這也提示牙周致病菌是否也有類似的結構和白蛋白結合，繼而引起一系列變化導致組織的破壞。既然HBA-GA復合物關系著致病微生物和宿主血清白蛋白之間的相互作用，研究二者可能會有助于揭示牙周致病菌的分子機制，以及為開發藥物以抑制細菌的生長繁殖開辟一個新的領域。與此同時，上調的轉鐵蛋白和纖維蛋白都與炎性滲出增加有關。而Rca-Rhogdi復合物通過Rhogdi調節Rho蛋白，但在炎癥中究竟有什么作用還不甚清楚。

本實驗未發現在牙周炎患者唾液中表達升高的防御素以及一些基質金屬蛋白酶等，這可能由于采用的實驗方法不同以及2-DE技術自身的缺點所致。對于蛋白質表達譜，希望比較2個不同樣品在2-DE膠上存在著特征點強度的不同。但很難得到精確的重復性。同時特定蛋白質的位置通常有微小變化。所以只能選擇重復性好的點進行鑒定，這樣就會損失一些可能有意義的蛋白。而且，由于樣品中高豐度蛋白的干擾和低豐度蛋白的低溶解度，造成低豐度蛋白很難被檢測到，恰恰這些蛋白是執行重要生物功能的蛋白質。這需在以后研究中進一步探索。

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