HIF-1α在進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)中的表達(dá)及ARB的干預(yù)作用

査 艷，胡 英，沈 燕，黃朝暉，俞 雷

(1貴州省人民醫(yī)院，貴陽(yáng)550004;2貴州省電力醫(yī)院)

腎臟纖維化是多種慢性腎臟疾病致腎衰竭的主要病理改變和共同通路。“慢性低氧學(xué)說(shuō)”是目前腎臟病學(xué)界的研究熱點(diǎn)，其認(rèn)為腎小管間質(zhì)細(xì)胞的慢性氧缺失是促進(jìn)腎臟纖維化的重要原因［1］。目前氯沙坦除用于降壓外，還用于臨床延緩腎功能不全進(jìn)展的治療，但其對(duì)腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不完全清楚。2008年10月～2010年10月，我們檢測(cè)了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)在進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)中的表達(dá)及氯沙坦的干預(yù)作用，旨在探討氯沙坦在慢性低氧狀態(tài)下對(duì)腎小管間質(zhì)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠(重慶騰鑫生物技術(shù)公司提供，二級(jí))25只，體質(zhì)量(126.7±10)g。氯沙坦購(gòu)自杭州默沙東制藥公司，小鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Neo Markers公司，小鼠抗人HSP47單克隆抗體購(gòu)于加拿大Assay Designs Stressgen公司。總RNA提取Trizol試劑購(gòu)于美國(guó) Gibco-BRL公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。全自動(dòng)多功能生化分析儀(日本Hitachi公司);SN-628放射免疫γ計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所);光學(xué)顯微鏡(日本O-lympus公司)。

1.2 造模及干預(yù) 將25只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、未給藥組、小劑量組、大劑量組各5只，假手術(shù)組只做腎包膜剝離，不做腎臟切除;后四組均參照文獻(xiàn)［2］制作進(jìn)展性腎炎致腎小管間質(zhì)纖維化模型，行右腎摘除術(shù);術(shù)后第1、2周于鼠尾靜脈注射IgG(OX-7)標(biāo)記小鼠單克隆抗Thy1.1抗體1.2 mg/kg 2次;2周后未給藥組、小劑量組、大劑量組則分別予氯沙坦0、20、80 mg/(kg·d)入飲水中灌胃至8周，除模型組于4周時(shí)麻醉下處死大鼠外，余組均8周時(shí)處死，收集24 h尿液，取大鼠心臟血并制作腎組織標(biāo)本。

1.3 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) ①收縮壓(SBP)。采用普升科技有限公司鼠尾無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)xLE5001測(cè)鼠尾SBP。②24 h尿蛋白定量。應(yīng)用雙縮脲法測(cè)定。③血肌酐(SCr)。采用日本Hitachi公司全自動(dòng)生化分析儀用化學(xué)法測(cè)定。④腎組織病理改變及腎間質(zhì)面積。5%中性甲醛固定腎組織，常規(guī)HE、PAS、PAM、MASSON染色，顯微鏡下觀察腎臟病理改變。200倍光鏡下每個(gè)標(biāo)本選取選10個(gè)腎小管間質(zhì)視野(避開(kāi)腎小球和大血管)，每個(gè)視野分別測(cè)量腎間質(zhì)面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積的比值。采用顯微圖象分析系統(tǒng)(Olympus C3040-ADU)對(duì)各組染色結(jié)果進(jìn)行積分光密度(IOD)測(cè)定，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(200倍)，每個(gè)視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計(jì)算其IOD值，取平均值。⑤HIF-1α、熱休克蛋白47(HSP47)mRNA表達(dá)測(cè)定。采用原位雜交法。取3 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)原性酶，熱修復(fù)抗原，抗原抗體反應(yīng)，DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。HIF-1α、HSP47mRNA原位雜交所用探針為經(jīng)地高辛標(biāo)記的針對(duì)HIF-1α、HSP47基因的多相寡核苷酸探針，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性產(chǎn)物呈深紫色，不加探針為陰性對(duì)照。HIF-1α、HSP47 mRNA表達(dá)以IOD值表示，數(shù)量級(jí)為×103。⑥相關(guān)性分析。對(duì)腎小管間質(zhì)中HIF-1α、HSP47 mRNA表達(dá)行Pearson相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

各組相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。PAS染色示假手術(shù)組腎小管間質(zhì)形態(tài)基本正常，模型組見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、部分腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并出現(xiàn)纖維化;未給藥組大部分腎小管上皮細(xì)胞脫落，管腔擴(kuò)張，管型堵塞，間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重。小劑量組腎小管間質(zhì)損傷得到改善;大劑量組腎小管間質(zhì)損傷得到顯著修復(fù)。HIF-1α mRNA表達(dá)主要集中于腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)，HSP47 mRNA表達(dá)主要集中于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)。相關(guān)分析示HIF-1α與HSP47 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.794，P ＜0.01)。

3 討論

表1 各組相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(n=5，±s)

表1 各組相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(n=5，±s)

注:與假手術(shù)組比較，◆P ＜0.01;與未給藥組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.01，★P ＜0.05;與小劑量組比較，▲P ＜0.01，◇P ＜0.05

mRNA HSP47 mRNA模型組 135±6◆ 101.22± 9.67◆ 156.54± 9.86◆ 0.18±0.03◆ 28.53±4.08◆ 44.52±4.27組別 SBP(mmHg) SCr(μmol/L) 尿蛋白(mg/d) 腎間質(zhì)面積 HIF-1α◆0.34 1.76 ±0.23未給藥組 148±5 163.04±13.45◆ 297.32±26.29◆ 0.26 ±0.05◆ 46.32 ±6.34◆ 53.92±5.01◆低劑量組 127±4 79.15± 3.93△★ 109.42± 7.49 0.13 ±0.02△ 20.28 ±2.73△ 26.49±3.06△大劑量組 101±5△★ 64.73± 4.92△＊ 53.21± 6.05△＊◇ 0.10 ±0.01△＊ 9.46 ±2.25△＊▲ 11.05±2.46△＊▲假手術(shù)組 112 ±3 56.35 ± 3.78 21.26 ± 3.07 0.08 ±0.01 2.36 ±

研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的主要因素之一［3］。低氧刺激產(chǎn)生的許多蛋白分子與腎纖維化密切相關(guān)，如低氧可使人近曲小管上皮細(xì)胞、人腎臟成纖維細(xì)胞TGF-βmRNA表達(dá)增加［4］，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解［5］。HIF-1屬于轉(zhuǎn)錄因子，是由 α/β 兩個(gè)亞基形成的異源二聚體。HIF-1α在體內(nèi)特異地受氧濃度調(diào)節(jié)，當(dāng)體內(nèi)氧濃度下降時(shí)，HIF-1α迅速在細(xì)胞內(nèi)積聚使細(xì)胞內(nèi)水平增加;當(dāng)恢復(fù)正常氧濃度時(shí)，HIF-1α蛋白很快被泛素降解;而HIF-1α對(duì)低氧不敏感，故HIF-1α蛋白可作為低氧的指標(biāo)［6］。腎小管間質(zhì)纖維化的重要特征是腎間質(zhì)膠原蛋白合成和沉積增加。HSP47是一種膠原特異性的“分子伴侶”，在膠原生物合成過(guò)程中協(xié)助前膠原修飾、折疊、裝配，其表達(dá)增加與間質(zhì)過(guò)度積聚膠原有密切關(guān)系［7～9］。但慢性低氧在進(jìn)展性腎炎中能否誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)細(xì)胞HSP47表達(dá)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

進(jìn)展性腎炎大鼠［2］是目前觀察慢性腎臟病進(jìn)展較理想的動(dòng)物模型，該模型于4～11周小管間質(zhì)的有效循環(huán)血流量下降近40%，出現(xiàn)持續(xù)的腎小管間質(zhì)缺血缺氧，有利于觀察低氧狀態(tài)對(duì)腎臟的損害。本研究結(jié)果顯示，模型組SBP、SCr、24 h尿蛋白均明顯高于假手術(shù)組，術(shù)后腎小管灶狀萎縮，出現(xiàn)間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)出與人類腎臟纖維化一致的病理過(guò)程，與 Matsumoto［2］研究結(jié)果一致。

氯沙坦為血管緊張素受體拮抗劑(ARB)，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制AngⅡ與其受體結(jié)合，且主要與AT1結(jié)合，阻斷AngⅡ引起的血管收縮、交感興奮、醛固酮分泌增多等作用，因而可以緩解腎損傷［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)應(yīng)用不同劑量的氯沙坦治療4周后，SCr、24 h尿蛋白均較模型組明顯減少，但大劑量組SBP與假手術(shù)組比較無(wú)顯著差異，說(shuō)明在保證血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定情況下，大劑量氯沙坦可明顯減少尿蛋白，改善腎功能。

已有研究表明，進(jìn)展性腎炎大鼠腎臟組織中存在小管間質(zhì)持續(xù)性的炎癥和缺血、缺氧。本研究結(jié)果顯示，模型組及未給藥組HIF-1α均明顯高于假手術(shù)組，說(shuō)明在發(fā)生小管間質(zhì)纖維化前腎小管存在明顯缺氧，與Manotham等［11］報(bào)道一致。目前雖無(wú)研究證實(shí)HIF-1α可直接通過(guò)調(diào)節(jié)HSP47表達(dá)，參與腎臟膠原合成增加致腎纖維化。但Kimura等［12］通過(guò)制作 pVHL-/-基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn) 60周齡的pVHL-/-小鼠腎間質(zhì)纖維化面積明顯增加，注射HIF-1α拮抗劑YC-1后可抑制pVHL-/-小鼠腎纖維化的進(jìn)展。因此認(rèn)為抑制HIF-1α表達(dá)是治療腎臟纖維化的新靶點(diǎn)。已有研究結(jié)果證實(shí)，氯沙坦能通過(guò)減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)來(lái)減輕腎臟纖維化［13］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)氯沙坦治療4周后，進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)纖維化顯著改善，HIF-1α及HSP47表達(dá)降低，可見(jiàn)在保證血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定情況下，大劑量氯沙坦不但能抑制，而且還可一定程度逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)的纖維化進(jìn)展。

綜上所述，氯沙坦可能通過(guò)干預(yù)進(jìn)展性腎炎大鼠HIF-1α表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

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