胃癌手術前后外周血CD4+CD25+調節性T細胞的變化及臨床意義

邱宇杰，侯計平，李富新，李衛東

（1.天津醫科大學總醫院普通外科，天津普通外科研究所，天津300052；2.天津市寶坻區人民醫院普通外科，天津 301800）

世界范圍內最常見惡性腫瘤中胃癌排第4名[1]。根據流行病學調查表明，日本、美國的胃癌發病率今年呈持續下降趨勢，但我國仍屬于胃癌高發國家。目前，胃癌的治療以手術為主，但由于胃癌診斷時病期已偏晚，外科治療的療效不夠滿意。大量研究已表明惡性腫瘤的發生、發展與多種因素有關，其中包括機體的免疫功能失衡，在此狀態下，腫瘤細胞逃避免疫細胞監控，發生免疫逃逸，最終導致腫瘤發生[2]。腫瘤的免疫內環境在腫瘤的形成發展過程中起到關鍵性作用。因此闡明腫瘤的發生、發展及預后與機體的免疫功能狀態的關系，可利于建立新的治療方法[3]。本研究目的旨在探索胃癌CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）的變化特征及其與臨床指標之間的關系，為新的治療方法提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 對象 在取得患者知情同意后，以天津醫科大學總醫院普外科2007年10月至2009年4月期間初治行手術切除治療的胃癌患者共38例作為研究對象，其中男性26例，女性12例，年齡43～85歲，中位年齡為56.00歲，平均年齡（60.13±11.50）歲。收集每一例病人的臨床資料，所有切除標本術后均得到病理學證實。同期隨機收集在我院進行體檢的健康者20例作為正常對照組，其中男性13例，女性7例，年齡40～78歲，中位年齡54.00歲，平均年齡（58.50±11.02）歲，并且所有受檢者外周血中生化和免疫指標均正常。兩組間性別和年齡經統計學分析無顯著性差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 材料 鼠抗人CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Per－CP、CD4-PerCP、CD25-FITC 單克隆抗體、紅細胞裂解液均為Becton Dickinson公司產品；4%多聚甲醛為武漢博士德生物工程有限公司產品。

1.3 免疫功能檢測 抽取胃癌組術前3 d、術后14 d以及正常對照組外周血，所有受試者外周血標本均在清晨空腹下抽取，血液標本均在抽血后6 h之內處理。血標本以CD4-PerCP、CD25-FITC單克隆抗體及CD4-FITC、CD8-PE、CD3-perCP單克隆抗體分別對CD4+CD25+調節性T細胞及CD3+CD4+CD8+T細胞亞群進行標記并進行流式細胞學檢測。所有受試者未進行過影響機體免疫狀態的任何干預，包括放射治療、化療以及生物治療。

1.4 統計學處理 實驗結果應用SPSS15.0統計分析軟件包處理。兩獨立樣本非參數檢驗應用Mann-Whitney Test，兩相關樣本非參數檢驗應用Wilcoxon one-sample方法，完全隨機設計多組樣本非參數檢驗比較應用Kruskal-Wallis Test，描述兩樣本相關性應用Spearman’s秩相關檢驗。檢驗水準α為0.05。

2 結果

2.1 胃癌患者外周血Treg、CD4+T細胞、CD8+T細胞的表達

2.1.1 胃癌患者外周血Treg的表達 胃癌患者術前外周血Treg比例顯著高于正常對照組，差異具有統計學意義；手術后外周血Treg比例與正常對照組比較，差異無統計學意義（表1）。胃癌患者術前外周血Treg比例顯著高于術后比例，差異具有統計學意義（表 2）。

表1 胃癌患者手術前、后與對照組外周血Treg、CD4+T及CD8+T細胞比例的比較*Tab 1 Comparisons of Treg,CD4+T cell and CD8+T cell between gastric cancer patients of pre-and post-operation and control

表2 胃癌患者手術后與手術前外周血Treg、CD4+T及CD8+T細胞比例的比較*Tab 2 Comparisons of Treg,CD4+T cell and CD8+T cell between gastric cancer patient of pre-and post-operation

2.1.2 胃癌患者外周血CD4+T細胞的表達 胃癌患者術前外周血CD4+T細胞比例與正常對照組相比，兩者之間差異無統計學意義；胃癌患者術后外周血CD4+T細胞比例與對照組比較，兩者之間差異無統計學意義（表1）。胃癌患者術后外周血CD4+T細胞比例與術前比較，兩者之間差異無統計學意義（表 2）。

2.1.3 胃癌患者外周血CD8+T細胞的表達 胃癌患者術前外周血CD8+T細胞比例明顯低于正常對照組，差異具有統計學意義；胃癌患者術后外周血CD8+T細胞比例與正常對照組比較，兩者之間無統計學差異（表1）。胃癌患者術后外周血CD8+T細胞比例明顯高于術前，差異具有統計學意義（表2）。

2.2 相關性分析

2.2.1 胃癌患者術前外周血Treg比例在不同淋巴結轉移情況和TNM分期之間差異具有統計學意義（P<0.05）（表3），其與淋巴結轉移和TNM分期呈正相關，相關系數分別為 0.521、0.533，P值均為0.001，與腫瘤浸潤深度、遠處轉移、腫瘤分化程度及病理類型均無相關性（P>0.05）。Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者外周血中Treg比例顯著高于Ⅰ期，差異具有統計學意義（P<0.008），Ⅳ期胃癌患者外周血中Treg比例亦顯著高于Ⅱ期，差異具有統計學意義（P<0.008），其它各分期之間胃癌患者外周血中Treg比例差異無統計學意義（P>0.008）。

2.2.2 胃癌術前術后外周血中Treg比例下降程度與浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、分化程度、病理分型以及手術方式均無相關性（P>0.05）。

2.2.3 胃癌患者術前、術后外周血CD8+T細胞比例與Treg比例呈負相關（表4）。

表3 有無淋巴結轉移、不同TNM分期之間胃癌患者術前外周血中Treg比例的比較Tab 3 Comparisons of Treg between different status of lymph node metastasis and TNM staging of gastric cancer patients

表4 胃癌患者手術前、后外周血Treg、CD8+T細胞比例的關系*Tab 4 Relationship between Treg and CD8+T cell of gastric cancerpatients of pre-operation and post-operation

3 討論

1995年，Sakaguchi等[4]首次分離獲得CD4+CD25+調節性T細胞亞群。隨著分子生物學的飛速發展，Treg作用機制逐漸被闡明，其調節功能在機體免疫穩態維持、移植耐受、腫瘤免疫、過敏反應及微生物感染等方面均得到了證實。正常狀態下，Treg調節正在進行的免疫反應和Treg的數量，預防自身免疫功能失調。其數量和功能的增高或減低，必然相應地導致免疫抑制（例如腫瘤或感染）或自身免疫（例如多發性硬化癥）[5]。大量的研究已表明惡性腫瘤的發生、發展與多種因素有關，其中包括機體的免疫功能失衡。近年研究發現，Treg在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中均有增高，提示腫瘤細胞可以產生一系列逃避抗腫瘤反應的機制，腫瘤患者體內Treg數量的增高即是抑制腫瘤免疫的機制之一，體外的試驗也表明Treg能夠抑制CD8+T細胞的增殖，提示該類細胞可能為腫瘤細胞的生長提供一個良好的環境，促進腫瘤的發展。在此狀態下，腫瘤細胞逃避免疫細胞監控，發生免疫逃逸，最終導致腫瘤發生[2]。

Treg在機體內維持一定的比例，在健康人外周血中能夠監測到Treg，其比例可在一定程度上反映機體的免疫狀態。本文正常對照組結果為（4.56±3.03）%，該比例指的是其群細胞與T淋巴細胞的比例，和文獻報道相一致，可以作為深入研究的對照基礎。Anna等[6]研究了42例不同上皮細胞來源的惡性腫瘤患者及健康人外周血的CD4+CD25+Treg分布情況，結果發現腫瘤患者外周血的CD4+CD25+Treg均有升高，而健康對照組未見升高。Shah等[7]研究了40例宮頸癌標本，CD4+CD25+Treg的高表達即意味著明顯下降的生存率。本文結果經統計學分析表明，胃癌患者術前外周血中Treg比例顯著高于對照組（P<0.01），而術后外周血中Treg與對照組無顯著差異；淋巴結轉移陽性胃癌患者術前外周血中Treg比例高于淋巴結轉移陰性患者（P<0.01）。胃癌患者外周血中Treg比例與淋巴結轉移呈正相關；各TNM分期之間胃癌患者術前外周血中Treg比例有顯著差異（P<0.05），進一步行各TNM分期之間兩兩比較發現，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者術前外周血中Treg比例均較Ⅰ期顯著增加（P<0.008），Ⅳ期胃癌患者術前外周血中Treg比例亦顯著高于Ⅱ期（P<0.008），表明Treg比例的增高使機體產生腫瘤免疫耐受，抑制機體的抗腫瘤免疫，最終導致腫瘤的發生。Treg比例在一定程度上反映疾病的進展情況，甚至能作為檢測疾病進展的免疫學指標。

本文結果顯示胃癌患者術前外周血中CD4+T細胞比例與對照組無顯著差異（P>0.05），說明CD4+T細胞不是影響腫瘤免疫的主要因素，而是其亞群Treg細胞參與腫瘤的免疫耐受，影響腫瘤的發生、發展。另一方面，胃癌患者術前外周血中CD8+T細胞比例明顯降低，且胃癌患者術前外周血CD8+T細胞比例與Treg比例呈負相關，術后外周血CD8+T細胞比例與Treg比例亦呈負相關，即隨著Treg比例的升高，CD8+T細胞比例下降。CD8+T細胞是主要的腫瘤免疫作用細胞之一，而腫瘤患者的這種細胞往往功能低下數量減少。提示Treg通過抑制CD8+T細胞的增殖以及抑制CD8+T細胞對癌細胞的細胞毒性作用，從而能夠促進癌細胞的生長和進展。Li等[8]利用抗CD25抗體去除小鼠體內的Treg，實驗結果顯示Treg數量減少達到90%以上時可誘導抗腫瘤反應的一系列過程，其中包括腫瘤特異性CD8+T細胞的激活以及浸潤腫瘤的CD8+T細胞數量的增多。

本文結果顯示胃癌患者外周血中Treg比例及其變化在不同腫瘤浸潤深度、遠處轉移、分化程度及病理類型間無顯著差異，這一結果說明以上情況不是影響胃癌患者Treg比例的主要因素。胃癌術前術后外周血中CD4+CD25+Treg比例差值在不同浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期之間的差異無統計學意義。另外，根治性手術胃癌患者術前術后外周血中CD4+CD25+Treg比例差值與姑息性手術比較，差異亦無統計學意義（P>0.05）。這提示無論腫瘤分期、分化程度、組織類型、原發灶深度及淋巴結轉移情況如何，能否行根治性手術，只要去除腫瘤本身，就可以使外周血中CD4+CD25+Treg比例下降。這也從另一方面闡明切除腫瘤有助于CD4+CD25+Treg比例下降，從而改善機體的抗腫瘤免疫能力。

本文結果提示Treg可能通過抑制CD8+T細胞的增殖及功能，促進腫瘤細胞的生長和發展，這可能是腫瘤患者免疫功能受到抑制的機制之一。去除腫瘤本身，Treg比例顯著降低，可以改善機體的抗腫瘤免疫能力，也說明了腫瘤本身在Treg細胞生成、增殖及聚集過程中起著重要作用。實驗結果顯示Treg與腫瘤的侵襲、淋巴結轉移有關，提示Treg在一定程度上可作為檢測疾病進展的免疫學指標。

［1］Conroy H,Marshall NA,Mills KH.TLR ligand suppression or enhancement of Treg cells?A double-edged sword in immunity to tumours[J].Oncogene,2008,27(2):168

［2］Ho PP,Steinman L.The aryl hydrocarbon receptor:a regulator of Th17 and Treg cell development in disease[J].Cell Res,2008,18(6):605

［3］Kamangar F,Dores GM,Anderson WF.Pattern of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:Defining priorities to reduce cancer Disparities in Different Geographic Regions of the World[J].J Clin Oncol,2006,24(14):2137

［4］Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151

［5］Cools N,Ponsaerts P,Van Tendeloo VF,et a1.Regulatory T cells and human disease[J].Clin Dev Immunol,2007,2007:89195

［6］Anna MW,Dominik W,Michael S,et al.Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients[J].Clin Cancer Res,2003,9(2):606

［7］Shah W,Yan X,Jing L,et al.A reversed CD4/CD8 ratio of tumorinfiltrating lymphocytes and a high percentage of CD4(+)FOXP3(+)regulatory T cells are significantly associated with clinical outcome insquamouscellcarcinomaofthecervix[J].CellMolImmunol,2010,8(1):59

［8］Li X,Kostareli E,Suffner J,et al.Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors[J].Eur Immunol,2010,40(12):3325