HPLC法測定血漿中辛伐他汀濃度

劉 晶 ，朱立勤 ，孫秀娟

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市第一中心醫院藥劑科，天津300192；3.天津市民政局老年病醫院，天津300110）

辛伐他汀為臨床常用治療高脂血癥的藥物，對膽固醇有抑制作用，臨床主要用于治療原發性高膽固醇血癥[1]。由于辛伐他汀為前體藥物，在血中含量較低，因此其血藥濃度測定較為困難。本實驗采用HPLC法測定，簡便靈敏，用于臨床上辛伐他汀血藥物濃度監測，取得良好效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 島津LC-10AVP高效液相色譜儀（LC-10AVP輸液泵，SPD-10AVP紫外檢測器，ANASTAR色譜工作站）；AR2140型電子分析天平；色譜分析柱 Kromasil C18(250 mm×4.6 mm 5 μm，天津市琛航科學儀器有限公司）；辛伐他汀片（浙江海正藥業集團有限公司，批號：091208，20 mg/片）；辛伐他汀標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：090402）；內標物洛伐他汀標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：090402）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。血漿樣品由天津市第一中心醫院提供。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（60∶40）；紫外檢測波長：237 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；靈敏度：0.002(AUFS)；進樣量：20 μL。

1.2.2 辛伐他汀儲備液的制備 精密稱取辛伐他汀標準品10 mg，加甲醇溶解稀釋于50 mL容量瓶中搖勻，再精密吸取此溶液10 mL，加甲醇溶解并稀釋于50 mL容量瓶中，制備成40 μg/mL的辛伐他汀儲備液。

1.2.3 內標液配制 精密稱取內標物洛伐他汀10.0 mg，加乙腈溶解并稀釋于100 mL的容量瓶中，搖勻，制成濃度為100 μg/mL的內標儲備液。再精密吸取此溶液0.2 mL，加乙腈溶解并稀釋于100 mL的容量瓶中，制備成200 ng/mL的內標供試液。

1.2.4 血樣處理 取標準血漿溶液0.5 mL，置于旋渦混合器上混勻5 min，用高速離心機（13000 r/min）離心5 min，取出上清液,置于60℃水浴上用氮氣吹干，用100 μL流動相復溶后，高速離心，取上清液20 μL待測。

1.2.5 辛伐他汀血漿標準曲線的制備 精密吸取空白血漿500 μL，置于具塞刻度試管中，精密加入辛伐他汀儲備液(40 μg/mL)適量，再精密加入內標供試液 500 μL，分別制成濃度為 5、10、50、100、200、500、1000 ng/mL的系列標準血漿溶液。按血樣處理方法操作以不同濃度辛伐他汀系列溶液的辛伐他汀峰面積（As）和內標峰面積（Ai）來計算Y（Y=As/Ai），以Y值為縱坐標，辛伐他汀濃度C為橫坐標進行直線回歸。

2 結果

2.1 辛伐他汀色譜圖 分別將空白血漿和辛伐他汀血漿標準溶液按血樣處理方法操作后進樣，得出色譜圖。血漿中內源性雜質不影響辛伐他汀與內標的分離測定，辛伐他汀與內標的保留時間分別為8.9 min和6.7 min。色譜圖見圖1。

圖1 血漿中辛伐他汀色譜圖A空白血漿，B辛伐他汀血漿標準溶液；1.內標物洛伐他汀 2.辛伐他汀

2.2 辛伐他汀血漿標準曲線 辛伐他汀在5～1000 ng/mL范圍內，血藥濃度與峰面積比有良好線性關系，其回歸方程為Y=0.0046C+0.122，r=0.9997。以信噪比S/N=3∶1計，辛伐他汀最低檢測濃度為2 ng/mL。

2.3 回收率及精密度 將10、100、500 ng/mL的標準血漿溶液按血樣處理方法項下操作，分別進樣5次，將辛伐他汀峰面積（As）與內標峰面積（Ai）之比Y代入標準曲線計算辛伐他汀血漿濃度，以測得值與加入值之比計算方法回收率。以1 d內測得的辛伐他汀濃度計算日內精密度，以1周內5次測定的辛伐他汀濃度計算日間精密度，見表1。

表1 回收率及精密度

3 討論

3.1 預處理方法選擇 目前國內外文獻報道血漿樣品預處理的方法多采用萃取法和沉淀法。本實驗曾嘗試用萃取法進行血漿樣品的預處理，使用含5%異丙醇的二氯甲烷等多種試劑進行提取，發現萃取操作復雜、耗時長，得出的色譜峰雜質較多，提取量與濃度之間線性不理想，二氯甲烷等有機溶劑毒性較大。因此本文采取沉淀法完成樣品預處理。文獻報告的沉淀法對儀器要求較高[2]，血樣反復用乙腈沉淀蛋白，處理過程復雜，結果準確性差，不能滿足本實驗檢測要求。本實驗對沉淀法進行了改進，用乙腈沉淀蛋白吹干、復溶再進行色譜分析，操作過程簡便快速，提高了準確性和精密度。

3.2 沉淀試劑的選擇 一般血樣處理中沉淀蛋白常用試劑為甲醇和乙腈[3-4]，本實驗在篩選條件時根據文獻選擇了甲醇、乙腈分別作為沉淀試劑，結果乙腈較前者的沉淀效果更為完全，雜質峰較少，因此本實驗選用乙腈用作蛋白沉淀劑。

3.3 流動相篩選 實驗中選擇了多種流動相體系，包括不同比例的甲醇∶水、甲醇∶乙腈∶水、乙腈∶水等作為流動相來篩選實驗條件，結果發現與甲醇相比，乙腈的洗脫能力強，以60∶40的乙腈∶水作為流動相，可以滿足色譜系統檢測的要求，并且系統分離效果較好，峰形對稱，柱效高，保留時間適宜。因此本實驗選擇乙腈∶水（60∶40）作為流動相。

近年來他汀類藥物在心血管疾病的治療方面起到非常重要的作用，其中辛伐他汀是此類藥物中使用較為廣泛的一種。本實驗采用高效液相的方法測定辛伐他汀血漿濃度，方法靈敏度高、操作簡便、回收率高、精密度好，可滿足臨床血藥濃度測定的需要。

［1］Wang D,Qin F,Chen L,et al.Determination of lovastatin in human plasma by ultra-performance liquid chromatography eLectrospray ionization tandem mass spectrometry[J].BiomedChromatogr，2008，22(5)：511

［2］申屠建中，章霞，陳志根，等.固相萃取反相高效液相色譜法檢測人血漿中辛伐他汀濃度[J].藥物分析雜志，2002，22(1)：18

［3］王東，秦峰，陳凌云，等.超高效液相色譜-質譜聯用法測定人血漿中的辛伐他汀[J].色譜，2008,26（3）:327

［4］張紅，徐文煒，胡曉，等.人血漿中辛伐他汀的HPLC-MS/MS測定[J].中國醫藥工業雜志，2006，37（12）:833