序貫法測(cè)定原位凝膠材料OALA的LD50

顧 娜，李 旭，鄧聯(lián)東，梁艷琴，王偉偉，胡人杰

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020；3.天津大學(xué)化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，天津300073）

原位凝膠是一種新型的具有控釋作用的藥物制劑材料[1]。與傳統(tǒng)的給藥系統(tǒng)相比，原位凝膠有著顯著的優(yōu)點(diǎn)。OALA屬于聚酸酐類原位凝膠材料，系由天津大學(xué)化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院研發(fā)的一種可生物降解高分子材料，由于其具有良好的表面溶蝕降解性[3]、生物相容性、結(jié)構(gòu)易改性、降解速率可調(diào)及易加工性等優(yōu)異性能，有望成為新型藥用輔料而在醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域得到應(yīng)用。本項(xiàng)研究通過(guò)OALA血管內(nèi)給藥對(duì)其使用安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其深入的生物學(xué)及藥學(xué)實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試藥 原位凝膠材料OALA：為白色片狀粉末，由天津大學(xué)化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM種小鼠，Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：sxck(京)2006-0008。標(biāo)準(zhǔn)化Ⅱ級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，IVC屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)：SYXK（津）2005-0001。普通全價(jià)顆粒飼料Ⅱ號(hào)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，京動(dòng)許字（2000）第015號(hào)，動(dòng)物飲用純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥劑量設(shè)計(jì) 采用序貫法[2-5]等體積給藥（即給藥體積相等，通過(guò)改變?nèi)芤核幬餄舛日{(diào)整給藥劑量）和等濃度給藥（即給藥溶液濃度不變，通過(guò)改變給藥體積調(diào)整給藥劑量）給藥方案。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定動(dòng)物存活率為100%與0的劑量，劑量間距設(shè)計(jì)為 1∶0.87。前者設(shè)計(jì)給藥濃度為 10、8.7、7.6、6.6、5.7、5mg/mL（給藥體積為0.4mL/20 g體重），后者設(shè)計(jì)給藥體積為 0.64、0.51、0.40、0.32、0.25、0.20mL（設(shè)計(jì)濃度為7.53mg/mL）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集 按從高劑量至低劑量的順序進(jìn)行靜脈注射，注射后觀察10min，若動(dòng)物出現(xiàn)死亡則降低一劑量組給藥，若動(dòng)物存活則提高一劑量組給藥，直至按照要求實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)5~6個(gè)“不死波谷”的周期劑量；對(duì)實(shí)驗(yàn)存活動(dòng)物描述其相關(guān)活動(dòng)；對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)病理解剖，摘取心臟、肺臟、肝臟、腎臟及腦組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，組織病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.3 LD50的計(jì)算 按照下述公式∶

X0為實(shí)驗(yàn)第一次出現(xiàn)陽(yáng)性（即存活）為中心組的劑量值，N為各實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)陽(yáng)性數(shù)的總和，A為各組陽(yáng)性數(shù)與組序之積再求和，B為各組陽(yáng)性數(shù)與組序平方之積再求和，i為劑量對(duì)數(shù)的公差項(xiàng)

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)情況 致死劑量OALA注射后動(dòng)物會(huì)即刻出現(xiàn)死亡，死亡均出現(xiàn)于給藥后1min之內(nèi)，死亡前動(dòng)物偶見(jiàn)排便現(xiàn)象。注射存活劑量后，動(dòng)物出現(xiàn)豎毛、臥伏不動(dòng)、身體傾斜、眼閉，嚴(yán)重者出現(xiàn)抽搐、跳躍等現(xiàn)象，4 h后恢復(fù)常態(tài)，繼續(xù)觀察1周，動(dòng)物未見(jiàn)異常。

實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)：劑量對(duì)數(shù)值之差（i）以4~6組可包括0%和100%死亡率為宜，第一次變號(hào)的前一次作為實(shí)驗(yàn)開始。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)圖1和圖2。

圖1根據(jù)計(jì)算公式，LD50=7.53mg/mL（給藥體積為 0.4mL/20 g體重）；Sm=0.017；95%可信限為7.53±0.576。

圖2根據(jù)計(jì)算公式，LD50=0.31mL（給藥濃度為7.53mg/mL）；Sm=0.081；95%可信限為 0.31±0.113。

最終計(jì)算兩種給藥方法小鼠靜脈注射給藥的LD50分別為150.6mg/kg和116.7mg/kg。

2.2 組織病理學(xué)觀察 病理組織觀察結(jié)果顯示，小鼠肺組織各級(jí)靜脈擴(kuò)張瘀血，血管腔可見(jiàn)藍(lán)灰色細(xì)顆粒狀材料，見(jiàn)圖3，其它組織器官未見(jiàn)病理組織學(xué)改變。通過(guò)動(dòng)物死亡時(shí)的表現(xiàn)以及組織病理學(xué)的觀察可以認(rèn)為動(dòng)物的死亡原因系由于急性、彌漫性肺栓塞所致。

3 討論

LD50的測(cè)定系評(píng)價(jià)生物樣品安全性的重要技術(shù)指標(biāo)，其測(cè)定方法主要包括Bliss機(jī)率單位法、簡(jiǎn)化機(jī)率單位法、寇氏法、目測(cè)圖示法、綜合計(jì)算法[2-5]等。與上述方法相比較，本實(shí)驗(yàn)所采取的序貫法特別適用于可迅速致死的樣品的測(cè)定且簡(jiǎn)便易行，節(jié)省動(dòng)物。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)測(cè)試樣品OALA靜脈注射可致動(dòng)物迅速死亡，故而在實(shí)驗(yàn)中采用本方法。

實(shí)驗(yàn)樣品OALA是一種新型的、用作藥物載體的溫敏型納米凝膠材料，該材料在體內(nèi)、外具有條件成膠的特性，即在一定的濃度（25%，W/W）下，一定的溫度范圍（體溫）內(nèi)形成凝膠。體內(nèi)成膠后OALA將在體液對(duì)其不斷的溶蝕作用下將其所載藥物釋出，從而達(dá)到控釋、緩釋作用。以往筆者所測(cè)定的OALA成膠條件均是由體外（試管內(nèi)）及動(dòng)物皮下植入所獲得的，血管內(nèi)途徑測(cè)試該樣品為首次。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，盡管測(cè)定LD50時(shí)筆者給入的樣品配制的濃度（1%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體外（體內(nèi)動(dòng)物皮下）成膠的濃度，但是在小血管和微循環(huán)中OALA作為“凝膠的性質(zhì)”仍然保留，即便濃度很低仍可成膠。這一現(xiàn)象是否提示體內(nèi)成膠濃度可低于體外成膠濃度，有待進(jìn)一步證實(shí)。

另外，由于OALA成膠與濃度具有明確的關(guān)系，即濃度越低越不容易成膠，在血管內(nèi)也是如此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，當(dāng)濃度（給入劑量）低到一定程度將不會(huì)造成動(dòng)物死亡，筆者曾經(jīng)嘗試不改變（致死）劑量而將給藥體積增加一倍，則可使“毒性”大幅度降低，這一結(jié)果也說(shuō)明了納米凝膠體系與生物體相互作用的復(fù)雜性，而這種復(fù)雜性是由這種新型制劑的特性所決定，也正是考慮到這種復(fù)雜性筆者在實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了等體積給藥方案和等濃度給藥方案。由此可見(jiàn)，如果想要綜合評(píng)價(jià)OALA（或其它凝膠體系）血管內(nèi)給藥的安全性，則還應(yīng)該設(shè)計(jì)更多的實(shí)驗(yàn)，更多、更全面地考慮凝膠特性與生物體的復(fù)雜性，才能得到更加可靠的，更加接近實(shí)際結(jié)論。

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