MBP-1分子真核表達載體的構建及其在食管癌細胞株Eca109中的高表達*

李雪婷，謝勇恩

(川北醫學院病理生理學教研室，四川 南充 637007)

MBP-1，又稱為c-Myc啟動子結合蛋白(c-Myc promoter binding protein)，我們通過實驗研究發現人食管上皮細胞在高濃度亞硝酸鹽沖擊誘導培養后MBP-1呈現下調表達［1］，由于MBP-1可以調控包括c-Myc在內的多個腫瘤相關基因的表達，是一個值得深入研究的調控分子。本研究構建了MBP-1分子真核表達載體并在食管癌細胞株Eca109中實現了高表達，為進一步探討MBP-1分子高表達對食管癌細胞增殖和凋亡的影響以及以MBP-1分子為靶點的食管癌基因治療等研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒載體和細胞株

質粒載體pcDNA3.1(+)由本研究室唐恩潔教授贈送。含MBP-1基因的質粒pCMV6-XLM購自Origene公司，食管癌細胞株Eca109購自中國科學院上海細胞生物研究所。

1.2 主要試劑

PCR擴增試劑、T4噬菌體DNA連接酶、限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ、質粒提取試劑盒、脂質體轉染試劑Lipofectin2000、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、硝酸纖維素膜、鼠抗MBP-1單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒均購自晶美生物公司，其余試劑為國產或進口分析純。

1.3 MBP-1基因的擴增

根據 GenBank中 MBP-1基因序列(GenBank accession number:GU170215)設計一對PCR引物，上游引物序列為:5'-gcaagcttatggatg gaacagaaaataaatctaag-3'，下 游 引 物 為:5'-gcggatccttacttggccaaggggtttctgaag-3'，上下游引物分別引入HindⅢ和BamHⅠ限制性內切酶位點。引物由大連寶生物科技有限公司合成。以質粒pCMV6-XLM為模板建立擴增體系，循環參數為:先94℃預變性3分鐘，然后進入循環，94℃ 變性1分鐘、55℃退火1分鐘、72℃延伸1分鐘，共30個循環，末次循環自動延伸7分鐘，擴增完畢后取10μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并對目的條帶進行膠回收純化。

1.4 重組質粒的構建

將MBP-1基因片段和質粒載體pcDNA3.1(+)經限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后，在T4噬菌體DNA連接酶作用下進行鏈接反應，取5μl鏈接液轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，取200μl轉化液鋪于LB平板固體培養基(含氨芐青霉素50μg/μl)，37℃孵育過夜，次日隨機挑取陽性克隆接種2ml含 50μg/μl的 LB 液體培養基，37℃ 振搖培養(16-18)小時后提取質粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測進行初步篩選，對重組質粒進行酶切和DNA測序鑒定。

1.5 細胞培養和轉染

食管癌Eca109細胞以相同細胞數接種25cm2細胞培養瓶，置CO2孵箱培養，當細胞達90%融合時用于轉染，細胞分為三組，每組3瓶細胞，第一組轉染重組質粒pcDNA3.1-mbp-1，第二組轉染質粒pcDNA3.1(+)，第三組不做任何處理，細胞轉染按脂質體轉染試劑Lipofectin2000操作說明書進行。

1.6 Western-blotting檢測

轉染72小時后收集細胞，每瓶細胞加入1ml蛋白裂解緩沖液，細胞裂解液置冰浴超聲處理1分鐘，4℃以12000轉/分離心10分鐘，收集上清液，采用Bradford法［2］測定各樣本蛋白質含量，調節各樣本的蛋白濃度使其相等。取蛋白樣品各10μl，加入等量2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸3分鐘后上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后用BR10592型半干轉移系統將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，膜用含50g/L脫脂奶粉的TTBS封閉3小時后，依次與鼠抗MBP-1單克隆抗體、酶標二抗結合，最后用增強型DNA顯色試劑盒顯色，凝膠成像系統攝像，用β-actin作為內參照進行相同印跡實驗，通過軟件對蛋白印跡條帶進行灰度值對比分析。

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定

隨機挑取轉化后生長出的10個陽性菌落，接種LB液體培養基(含氨芐青霉素50μg/μl)，37℃振搖培養16小時后，用質粒提取試劑盒提取質粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結合紫外光燈觀察發現2個分子量比載體質粒pcDNA3.1(+)大的質粒，對其中一個大分子量質粒用限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切1小時，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結合紫外光燈觀察發現該大分子量質粒能夠切下大小約為1kb的插入片段，其大小與MBP-1基因大小相符(見圖1)，DNA測序表明插入片段的核苷酸序列與GenBank中MBP-1基因序列完全一致，表明重組質粒構建成功，并命名為pcDNA3.1-mbp-1。

2.2 MBP-1在食管癌細胞實現高表達

取重組質粒pcDNA3.1-mbp-1轉染細胞裂解液、質粒pcDNA3.1(+)轉染細胞裂解液和空白對照細胞裂解液各10μl，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，依次與一抗、二抗反應，最后顯色，結果發現 MBP-1分子在質粒 pcDNA3.1(+)轉染細胞和空白對照細胞表達量基本相同，MBP-1分子在重組質粒pcDNA3.1-mbp-1轉染細胞表達量明顯增高，其灰度值約為質粒 pcDNA3.1(+)轉染細胞的2.1倍，見圖2。

3 討論

MBP-1和TATA結合蛋白均能與c-Myc基因P2啟動子區的小溝特異性結合，阻止c-myc基因轉錄起始復合物的形成，從而負向調控c-Myc基因的表達［2，3］。目前研究發現，MBP-1 可能是一種具有多種生物學活性的轉錄抑制因子，可參與多個基因的轉錄和表達調控［4，5］。Ghosh AK 等［6］研究發現，前列腺癌細胞中高表達MBP-1可使MEK5α表達降低，這種降低可能與MEK5α的過度泛素化和經蛋白酶體降解增多有關，MEK5α表達降低會抑制MAPK信號途徑的活性，使癌細胞的生長減慢。在另一項研究中，Ghosh AK等［7］還發現，MBP-1可抑制bcl-XL基因啟動子活性，下調bcl-XL基因的表達，由于bcl-XL分子可阻止線粒體細胞色素C的釋放，發揮抗凋亡作用，MBP-1通過下調bcl-XL分子表達可能促進細胞凋亡。

由于我們發現人食管上皮細胞在高濃度亞硝酸鹽沖擊誘導培養后MBP-1呈現下調表達，我們想知道MBP-1分子是否與食管癌的發生發展存在某種相關性。這就必須對MBP-1進行相關分子功能研究，可以通過基因敲除或RNA干擾技術抑制食管癌細胞MBP-1分子表達，然后觀察其對癌細胞生長等生物學行為的影響，也可以人為導致MBP-1分子在食管癌細胞高表達，然后觀察其對癌細胞的影響，在本研究中我們首先采用基因定向克隆技術構建了MBP-1高效真核表達載體，轉染食管癌細胞后實現了MBP-1分子的高表達，在進一步研究中，我們將觀察MBP-1分子的高表達對食管癌細胞增殖和凋亡的影響，同時建立荷瘤裸鼠動物模型，觀察MBP-1高表達能否抑制腫瘤的生長。

總之，本研究成功構建了MBP-1分子真核表達載體并在食管癌細胞中實現了高表達，為進一步深入探討MBP-1的分子功能并探索以MBP-1分子為靶點的食管癌基因治療等研究奠定了基礎。

［1］Xie Y，Tang E，Ren B，et al.Overexpression of S-adenosyl homocysteine hydrolase and down-regulation of prohibitin and c-Myc binding protein in the human esophageal squamous cell line HEEC exposed to N-nitrosomethyl-benzylamine［J］.Molecular Medicine Reports，2010，3(3):503 － 508

［2］Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(1):248 －254

［3］Ray R，Miller DM.Cloning and characterization of a human c-myc promoter binding Protein［J］.Mol Cell Biol，1991，11(4):2154 －2161

［4］Hsu WK，Hsieh RH，Wu CW，et al.MBP-1 suppresses growth and metastasis of gastric cancer cells through COX-2［J］.Molecular Biology of the Cell，2009，20(11):5127 －5137

［5］Steele R，Mott J，Ray RB.MBP-1 upregulates miR-29b that represses Mcl-1，collagens，and matrix-metalloproteinase-2 in prostate cancer cells［J］.Genes Cancer，2010，1(4):381 － 387

［6］Ghosh AK，Steele R，Ray RB.C-myc promoter-binding protein 1(MBP-1)regulates prostate cancer cell growth by inhibiting MAPK pathway［J］.J Biol Chem，2005，280(14):14325 － 14330

［7］Ghosh AK，Majumder M，Steele R，et al.MBP-1 mediated apoptosis involves cytochrome c release from mitochondria［J］.Oncogene，2002，21(18):2775 －2784