噬菌體展示技術*

馮 俊，李 麗，劉 海，劉世喜

(1.四川大學華西醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，四川 成都 610041;2.川北醫學院病理教研室;3.川北醫學院附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，四川 南充 637000)

1 噬菌體展示技術的研究歷史

噬菌體展示技術是近年才發展起來并得到廣泛應用的新技術，Smith［1］于1985年首次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使編碼的目的基因的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創建了噬菌體展示技術，將絲狀噬菌體fd基因組通過基因工程的手段進行改造，將EcoRⅠ內切酶的部分基因片段與PⅢ基因融合，獲得的重組噬菌體可在體外穩定增生。1988年Pannley et等［2］，將已知抗原決定族與PⅢ的N端融合呈現在表面，可特異性地被抗體選擇出來，并提出通過構建隨機肽庫可以了解抗體識別的抗原決定簇表位的設想。

2 噬菌體展示技術的基本原理

噬菌體展示技術是一種親和選擇和基因表達產物相結合的技術，以改造的噬菌體為載體，將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該病毒粒子內，通過檢測病毒內部的DNA來測定融合蛋白序列。噬菌體展示技術使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯系，使得各種靶分子的多肽配體通過一種被稱為淘選的體外選擇程序得以快速鑒定(如圖1)。噬菌體結構蛋白PIlI和PⅧ均可作為載體來展示外源多肽或蛋白質。在成熟蛋白質編碼區與信號肽之間有單一的克隆位點用于插入，插入的外源多肽或蛋白質以融合的形式表達在病毒粒子的表面，外源多肽或蛋白的插入結合點在N端，與PⅧ基因融合時，拷貝數高，可達2700個;與PllI基因融合時拷貝數低(約5個拷貝數)，利于選擇高親和力的配體分子，因而可對插入較大的片段進行篩選。

3 噬菌體展示系統

3.1 單鏈絲狀噬菌體展示系統

絲狀噬菌體常見的如M13、f1、fd等是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白;PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白;PⅢ位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染所必須的［3］。PⅧ位于噬菌體外側，N端伸出噬菌體外，C端與DNA結合，每個病毒顆粒大約有2700個拷貝。此外，尚有絲狀噬菌體PVI展示系統的研究報道［4］PVI蛋白可以作為外源蛋白的融合位點，可以用于研究外源蛋白C端結構區域功能，從而用于cDNA展示文庫的構建。

3.2 λ噬菌體展示系統

λ噬菌體的尾部管狀部分由PV蛋白構成，由32個盤狀結構組成尾部管狀結構，由6個PV亞基組成一個盤狀結構。PV有兩個折疊區域，外源序列替換或插入在c端的折疊結構域。λ噬菌體的D蛋白參與野生型噬菌體頭部的裝配。

3.3 T4噬菌體展示系統

T4噬菌體展示系統是將噬菌體衣殼表面上的SOC外殼蛋白和HOC融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失，故而T4可展示各種大小的多肽或蛋白質。

4 噬菌體展示技術的應用

4.1 噬菌體隨機多肽文庫

肽庫由感染性噬菌體構成，通過淘選可以富集與靶分子結合的噬菌體。隨機肽庫的篩選分子包括抗體、細胞表面受體類、小分子、完整細胞、細胞分子類［5，6］等，這些分子謂之受體，篩選出的結合該類受體的目的分子稱為配體。目前應用較多的是進行抗體的表位分析，而篩選出的配體常常展示了抗原抗體的結合部位。噬菌體展示肽庫發展較快，已由最初的6肽、7肽、發展到9肽、15肽，直到38肽、40肽［7，8］。Blond-Elguindi［9］等采用甲胎蛋白(AFP)洗脫的策略篩選出Bip結合短肽的共有序列，闡明Bip識別和蛋白質折疊的機制。Doorbar［10］等采用競爭洗脫的方法篩選出細胞表面受體特異性結合的短肽;張旭［11］等成功地篩選出肝癌特異性的短肽FQPLPAT;Pasqualini［12］等成功地篩選出腸和胃組織特異性的短肽，以及我們最近利用噬菌體隨機展示技術篩選出喉癌特異性結合的短肽-WPSTYMNPFNRS(未發表)等。

4.2 抗體工程與噬菌體展示技術

利用噬菌體展示技術可篩選到親和力和特異性都較高的抗體，噬菌體展示技術的發展使抗體工程進入又一次革命。McCaffery［13］等證實，完整的抗體可變區可展示于噬菌體的表面，通過篩選獲得了與已知抗原特異性結合的抗體片段。Hogrefe［14］等篩選到特異的Fab片段。噬菌體抗體庫構建和單克隆抗體的篩選是噬菌體展示技術的成功應用。

4.3 蛋白質工程與噬菌體展示技術

4.3.1 新受體和配體的發現:利用噬菌體展示技術，最近發現了一些新的受體及其配體［15－17］。Heiskanen等用完整的Puumala漢坦病毒進行淘選，其分離的多肽能與漢坦病毒結合，并使該病毒不能感染或結合細胞。

4.3.2 蛋白與蛋白間相互作用的研究:噬菌體展示技術和蛋白水解作用相結合可篩選穩定折疊的蛋白，從而能更好的研究蛋白與蛋白間相互作用［18－21］。由于這種方法不依賴蛋白的特異性，理論上講它適用于任何蛋白，故用此種方法可生產新的高適溫性蛋白，可使多肽片段形成新的折疊結構域，部分折疊區形成完全折疊。

4.3.3 蛋白質的定向設計和空間結構:可用來篩選細胞因子、酶抑制劑、細胞因子拮抗劑、轉錄因子的DNA結合位點、新型酶和生物學活性的蛋白質等領域。

4.3.4 抗原表位分析:抗原表位分析在研究抗原一抗體反應機制方面具有重要意義，通過噬菌體展示技術篩選出任何抗原的特定抗體［22，23］。此技術還可用于設計多肽疫苗、研制診斷試劑和篩選藥物等領域。Motti［24］用15肽庫篩選2株抗人乙肝表面抗原，而獲得的多肽不僅可以與抗人乙肝表面抗原單抗結合，而且可被乙肝患者的血清抗體識別。

4.3.5 噬菌體展示技術與藥物工程:由于對蛋白質結構與功能關系不夠了解，以往只能通過大規模的定點突變和單個目的蛋白的克隆表達純化與篩選來修飾現有蛋白，此方法費時費力。而使用噬菌體展示技術就可以簡便快速地獲得與靶分子具有強親和力和特異性的小肽或新型蛋白作為候選藥物開發。目前該技術已廣泛用于癌癥的靶向治療，組織器官移植、艾滋病、心血管病、神經性疾病等領域藥物的研究和開發，并已篩選出大量的受體拮抗物、酶抑制劑等［25］。

5 問題與展望

綜上所述，噬菌體展示肽庫技術以其獨特的優勢，在生物醫學的許多領域應用非常廣泛［26－32］，為后來的研究者提供了嶄新的研究方向。其中，定位抗原表位是最具應用前景的;運用噬菌體展示技術可篩選出與腫瘤細胞特異結合的多肽，從而為腫瘤的靶向治療提供了可能。另外，噬菌體展示肽庫技術亦還有很多不足需要改進方面:如篩選的特異性不高、如何更有效的避免篩選背景的影響、提高庫容量;改善密碼子的表達偏性等。但相信不久的將來，隨著該技術的進一步發展和完善，人們完全可以篩選和鑒別出更多、更廣的靶分子，并創造出具有實際應用價值的模擬肽;使噬菌體展示技術在更多領域中應用，產生更深遠的影響。

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