木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及木聚糖酶基因（Xyn B）的克隆

廣西人口和計(jì)劃生育研究中心 莫 毅梁方方＊ 賴志強(qiáng) 盧玉發(fā) 廖玉英

廣 西 畜 牧 研 究 所 何仁春 黃麗霞

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 楊 琳

木聚糖是一種由β-1，4-木糖苷鍵連接形成并帶有多種取代基的多聚糖，主要存在于植物細(xì)胞壁中，在自然界中是除纖維素之外第二豐富的可再生物質(zhì)資源（Prade，1995）。植物性飼料中含有大量木聚糖，它們?cè)趧?dòng)物消化道內(nèi)，不易被消化酶消化，從而增加了動(dòng)物消化道內(nèi)的食糜黏性，降低飼料消化率和營(yíng)養(yǎng)的吸收（張曉暉等，2007）。微生物木聚糖酶能水解木聚糖生成長(zhǎng)度各異的木寡糖，對(duì)半纖維素降解起著關(guān)鍵作用，其中以內(nèi)切方式降解木聚糖分子中1，4-β-D木糖苷鍵的O-糖苷水解酶（O-glycoside hydrolases）為主，其水解產(chǎn)物主要為木糖、木二糖及木三糖等低聚木糖，還有少量阿拉伯糖（徐君飛等，2007）。研究表明，木聚糖酶可改善消化道功能、增強(qiáng)免疫力、提高飼料利用率和生產(chǎn)性能、減少糞便對(duì)環(huán)境的污染（楊會(huì)濤等，2007）。

為了獲得酶活性較高的木聚糖酶產(chǎn)生菌，本試驗(yàn)從長(zhǎng)期堆放青貯飼料堆下土壤中取樣，并通過(guò)木聚糖富集培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基分級(jí)篩選出一株產(chǎn)木聚糖酶活性較高的菌株，對(duì)其進(jìn)行了細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定、16 S rRNA PCR擴(kuò)增鑒定；而后使用Oligo 6.44生物軟件，根據(jù)上述鑒定結(jié)果，以Genebank中公布的木聚糖酶Xyn B基因序列為模板，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增其Xyn B基因，為日后木聚糖酶Xyn B基因的重組高效表達(dá)和在動(dòng)物飼料添加劑中應(yīng)用提供材料。

1 材料與方法

1.1 土樣 土壤樣品取自廣西畜牧研究所黃牛室長(zhǎng)期堆放青貯飼料堆下，采集富含腐敗木質(zhì)纖維材料的土壤樣品若干份。采集時(shí)用小鏟子除去表土后離地面5～15 cm處取樣，盛于事先滅菌帶塞子的試管中。

1.2 酶和主要試劑 Taq DNA聚合酶，dNTPs和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa公司，木聚糖購(gòu)自Sigma公司，其他常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 富集培養(yǎng)基（g/L）木聚糖 10，蛋白胨 5，氯化鈉 5，pH自然，121℃滅菌20 min（陳勇等，2009）。

1.3.2 平板篩選培養(yǎng)基（g/L）木聚糖10，硝酸鉀l，硫酸鎂 0.2，氯化鈉 0.5，磷酸氫二鉀 0.5，瓊脂20，pH 自然，121 ℃滅菌 20 min（陳勇等，2009）。

1.3.3 斜面培養(yǎng)基（g/L）木聚糖8，酵母膏5，硫酸鎂0.2，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.5，硫酸錳0.005，瓊脂 20。pH 自然，121℃滅菌 20 min（陳勇等，2009）。

1.4 方法 采取土樣→無(wú)菌水浸提 （取上清液）→富集培養(yǎng)→取上清液涂布平板篩選培養(yǎng)基→分離純化→透明圈大的菌株為優(yōu)良菌株→16S rRNA鑒定→木聚糖酶XynB基因克隆。

1.5 菌種的富集、分離、篩選和純化 稱取1 g土壤樣品放入l00 mL無(wú)菌PBS的三角瓶中，放入搖床，37℃，200 r/min振蕩，將土樣搖散后培養(yǎng)1 h。取出靜置，按無(wú)菌操作要求取1 mL上清液接入富集培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將經(jīng)過(guò)富集的菌液取出離心，依次稀釋成10-6，10-7，10-8倍，取菌液0.2 mL涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)48 h。挑選透明圈較大的單菌落，轉(zhuǎn)接到新鮮的分離平板進(jìn)行反復(fù)純化。配制斜面培養(yǎng)基，將純化的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，測(cè)量透明圈的直徑，所有數(shù)據(jù)是重復(fù)3次的平均值。然后，選定透明圈最大且透明的菌株作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)菌。

1.6 菌種形態(tài)學(xué)特征鑒定 參照Dong和Cai（2001）通過(guò)革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.7 16S rRNA鑒定 本試驗(yàn)采用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）：

16SrRNAF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇

16SrRNAR：5＇-GGTTACCTIGTTACGACTT-3＇

挑取少許培養(yǎng)24 h的斜面菌種，加入1.0 mL無(wú)菌水中制成菌懸液，作為PCR反應(yīng)的模板，PTC-200 PCR儀（美國(guó)MJ公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 50 μL， 含有模板 2.0 μL，10 mmol/L 正 反 引 物 各 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10×Reactions Buffer 5.0 μL，2 U rTaq 酶，ddH2O補(bǔ)足 50 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 45 s，53.5℃退火 50 s，72℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；72℃后延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)見(jiàn)圖1，并送于上海鼎安生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast程序與Genebank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析（Naveen等，2000）。

1.8 木聚糖酶Xyn B基因克隆 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA鑒定結(jié)果，從Genebank中調(diào)取枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis strain）的木聚糖酶Xyn B基因的cDNA序列，并以此為模板，使用Oligo 6.44軟件設(shè)計(jì)其特異引物，引物序列如下：

Xyn B F：5＇ -GAATTCCATCATATGTTTAAGTTTAAAAAGAAT-3＇

XynB R：5＇-TCTAGATGATGCCACACTGTTTTAGAAC-3＇（刪除TAA終止子密碼）

使用與16s rRNA類似的PCR程序，只是退火溫度改為45℃，進(jìn)行木聚糖酶Xyn B基因的擴(kuò)增見(jiàn)圖1。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，回收片段與pUC18-T vector連接過(guò)夜后，連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E coli DH5α（曾靜等，2002）；在含氨芐青霉素的 LB選擇培養(yǎng)基中，挑取白色菌落，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR檢測(cè)后，送于上海鼎安生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列通過(guò)Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析 （Naveen等，2000）。

2 結(jié)果分析和討論

2.1 木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選 將采集的土壤經(jīng)富集培養(yǎng)及大量平板劃線培養(yǎng)分離，得到比較單一的菌落，此過(guò)程得到7株較純菌株。將這些菌株分別接種到斜面培養(yǎng)基，每株點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)后測(cè)量透明圈的直徑，所有數(shù)據(jù)是重復(fù)3次的平均值。分離到的7株菌的形態(tài)特征，及其透明圈測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)透明圈的大小在一定程度上反應(yīng)了菌株產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱。挑選其中透明圈較大且透明的菌株轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，并用封口膜封存置于4℃冰箱內(nèi)保存。選擇產(chǎn)生透明圈最大的菌株X7，作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)菌。

表1 木聚糖酶產(chǎn)生菌株的形態(tài)特征及透明圈測(cè)量結(jié)果

2.2 菌株形態(tài)特征鑒定 菌株X7革蘭氏染色反應(yīng)為陽(yáng)性；呈桿狀，無(wú)莢膜，周生鞭毛；形成芽孢，呈橢圓到柱形，芽孢生長(zhǎng)時(shí)菌體會(huì)稍微增大；在斜面培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)較快，呈淡黃色菌落，表面粗糙不透明。

2.3 16S rRNA序列分析鑒定 使用16S rRNA通用引物從菌株基因組中擴(kuò)增出約1.5 kb的目的片段，PCR產(chǎn)物交由上海鼎安生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，菌株X7與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain GD3b，Genebank 編碼HM055602.1）同源性最高為98.5%，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）庫(kù)中其他記錄的16S rRNA均有90%以上的同源性。結(jié)合菌株形態(tài)特征鑒定和16S rRNA序列分析鑒定，故該菌株X7應(yīng)隸屬于枯草芽孢桿菌屬。

2.4 木聚糖酶Xyn B基因克隆及序列分析 使用枯草芽孢桿菌Xyn B基因特異引物從菌株X7基因組中擴(kuò)增出約0.6 kb的目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，與pUC18-T vector連接獲得陽(yáng)性克隆pUC-Xyn B，挑選陽(yáng)性克隆交由上海鼎安生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用GeneBank中Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明：pUC-Xyn B測(cè)序結(jié)果與GeneBank中公布枯草芽孢桿菌的Xyn B基因序列同源性為99.0%，克隆子484位和499位核苷酸堿基發(fā)生突變，分別為（A）CG-（T）CG，AC（T）-AC（C）；相應(yīng)的氨基酸突變前者為錯(cuò)義突變T-S，后者為同義突變T-T。

3 結(jié)論

本研究中成功篩選到了7株木聚糖酶產(chǎn)生菌，并選取透明圈最大的木聚糖酶產(chǎn)生菌X7作為基礎(chǔ)菌，對(duì)其進(jìn)行16 s rRNA部分序列PCR擴(kuò)增測(cè)定，經(jīng)BLAST同源性分析確定X7為枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis strain GD3b（Genebank 編碼：HM055602.1）。然后，從 GeneBank中獲取枯草芽孢桿菌Xyn B基因序列，設(shè)計(jì)特異引物從X7菌株中克隆相應(yīng)的目的基因。為日后構(gòu)建木聚糖酶Xyn B基因酵母表達(dá)載體，培育能夠分泌表達(dá)具有高活性的木聚糖酶酵母工程菌奠定了基礎(chǔ)。

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