蛋白激酶C對Bcl-2、Bax調控兔脊髓空洞前狀態神經元凋亡的影響

李秀山 孫國柱 高曉偉 楊雷方 王目綱 劉性強 韓仰軍

(河北省館陶縣人民醫院神經外科,河北 館陶 057750)

脊髓空洞前狀態是脊髓空洞癥形成的最初始病理變化,業已證實是脊髓空洞防治的最佳時間窗〔1〕。有證據表明,在神經系統發育和急慢性損傷中可見到凋亡發生〔2,3〕,本課題組前期研究也證實脊髓空洞前狀態中存在神經細胞凋亡〔4〕。近年來,文獻報道在細胞信號傳導中起重要作用的蛋白激酶C(PKC)參與了神經元的缺血性損傷,特別是神經元凋亡〔5〕。但脊髓空洞前狀態PKC的激活在神經細胞凋亡中所起的作用未見報道,為此,本研究通過測定動物模型上頸髓神經細胞胞質與胞膜 PKC的活性變化及Bcl-2、Bax表達變化,探討PKC激活參與脊髓空洞前狀態神經細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康、體重1.5～2.0 kg的新西蘭白兔56只由河北醫科大學實驗動物中心提供,隨機分為三組,其中高嶺土(Kaolin)組40只,生理鹽水組和假手術組各8只。Kaolin(分析純)購于上海試劑四廠。Pep Tag非放射性PKC活性檢測試劑盒購于美國Promega公司。鼠抗Bcl-2單克隆抗體、鼠抗Bax單克隆抗體,均為Santa Cruz公司產品。細胞凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德公司。

1.2 模型制作 應用氯胺酮(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉,按文獻方法制作動物模型〔6〕;生理鹽水組動物枕大池僅注入37℃生理鹽水0.6 ml;假手術組動物僅行枕大池假穿刺以作對照。術后分籠飼養,自由進水,連續7 d肌肉注射抗生素預防感染,必要時予以營養支持。模型成功的標志:枕大池穿刺抽出無色、透明腦脊液,Kaolin順利注入枕大池且動物出現一過性四肢癱。

1.3 術后神經功能判定 術后每日應用改良的Tarlov評分法對動物進行行為學評分,標準如下:0分:無自主活動;1分:僅限于髖膝關節的非反射性運動;2分:髖膝踝3個主要關節的活動;3分:能主動支持體重和不協調步態,或偶爾出現協調步態;4分:前后肢協調步態,行走時有趾間關節運動;5分:正常步態。

1.4 標本的制作和采集 對照組(生理鹽水組和假手術組)在術后,Kaolin組動物分別在術后第1,3,7,14,21天各組隨機選取8只,在氯胺酮過度麻醉下斷頭處死,取出上頸髓,其中10 mm頸髓在-70℃低溫保存備PKC活性測定之用;剩余置入40 g/L多聚甲醛固定液中后固定24 h,常規脫水、透明、石蠟包埋、4μm切片,用于組織學觀察和免疫組織化學染色觀察。

1.5 底物磷酸化法測定脊髓PKC活性

1.5.1 胞膜/質蛋白提取 各實驗操作均在4℃以下進行。切取100 mg標本,勻漿粉碎,100 000 g離心1 h,上清液為胞漿蛋白,移至另一管中;沉淀部分加入胞膜蛋白提取液,超聲波助溶、過夜,100 000 g離心1 h,上清即為胞膜蛋白。

1.5.2 PKC活性測定 采用美國Promega公司的 Pep Tag非放射性PKC活性檢測試劑盒。按說明書將提取的膜性和胞漿PKC蛋白分別與PepTag C1肽、PKC激活溶液共同孵育30 min,上樣于0.8%瓊脂糖凝膠,恒壓(100 V)電泳約20 min,即有磷酸化部分的分離條帶明顯出現,用刀片快速從陰極取下包括磷酸化部分的條帶(體積約250μl),加熱融化。在凝膠溶解液中搖勻,置于570 nm波長下,讀取吸光度,并按說明書計算PKC活性,用 pmol·min-1·mg protein-1表示。

1.6 Bcl-2和Bax免疫組化染色 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學染色試劑盒進行染色。采用HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統,每張切片任取5個視野,高倍鏡下記數總細胞數和陽性細胞數,計算陽性細胞百分比。

1.7 TUNEL法檢測細胞凋亡 按試劑盒說明書操作。高倍視野(×400)下計算凋亡指數(AI),即每張片選取5個陽性細胞數最多的高倍視野,計算出平均陽性細胞百分數。

1.8 統計學分析 應用SPSS10.0統計軟件,各組數據以x ±s表示,采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1 術后動物神經功能改變 Kaolin組動物除術后出現一過性四肢癱外,于術后第3天出現進食減少、精神萎靡;第7天出現神經功能障礙,包括反應遲鈍、四肢無力、行走不穩,甚至癱瘓,并隨時間的延長而逐漸加重,甚至有的動物出現脊柱側彎。與生理鹽水組和假手術組比較差異顯著 (P＜0.05)。見表1。

2.2 光鏡觀察結果 Kaolin組動物于術后第3天神經細胞特別是神經元輕度腫脹。第7天細胞周圍間隙明顯較前增大,神經元水腫加重,核膜、核仁稍顯模糊,管周組織略顯疏松(圖1A),Kaolin性肉芽腫與脊髓粘連較輕。第14天細胞周圍間隙較前進一步增大,核膜、核仁模糊甚至消失,神經元胞體內尼氏體減少或消失 (圖1B),中央管飽滿,室管膜細胞受壓變平,管周組織疏松,呈明顯水腫改變;蛛網膜下腔可見Kaolin沉積,大量炎性細胞浸潤。第21天脊髓組織結構明顯紊亂,水腫稍顯減輕,胞質出現空泡,前角神經元數量減少,膠質細胞增生 (圖1C),中央管張力增加,室管膜上皮斷裂、脫落,Kaolin性肉芽腫形成。生理鹽水組和假手術組動物脊髓神經元輪廓正常,核及核仁清楚,胞質內尼氏體分布均勻,神經膠質細胞正常。

2.3 脊髓空洞前狀態中細胞凋亡情況和Bcl-2、Bax表達變化Kaolin組動物術后各個時間點神經元均有凋亡發生。典型的凋亡細胞表現為染色質凝集、邊集化,聚集于核膜下 (圖2A)。Bcl-2、Bax陽性細胞為細胞內有棕黃色粗顆粒或棕黃色細膩顆粒彌漫分布 (圖2B、2C)。神經元凋亡于術后第1天增加,7～14 d達高峰,以后逐漸降低,21 d仍可見到凋亡發生。Bax陽性表達趨勢與神經元凋亡基本一致,且Bax陽性表達明顯強于Bcl-2。正常對照組和假手術組僅見少量凋亡的少突膠質細胞,Bcl-2、Bax亦僅有少量弱陽性反應細胞。見表1。

2.4 胞膜、胞質PKC活性變化 Kaolin組動物術后第1天上頸髓神經細胞胞膜PKC活性就開始增高,第7～14天達到最高峰,21 d開始回落;胞質PKC活性則出現相反變化趨勢,即術后第1天開始降低,7～14 d達到最低點,21 d有所回升。定量分析結果發現:Kaolin組動物術后1 d胞膜PKC活性增加70%;7～14 d達到最高點,增加3倍之多;21 d開始回落,但仍高于正常 (P＜0.05)。胞質PKC活性呈相反趨勢,術后1 d出現降低;7～14 d達到最低點,降幅達50%;21 d開始回升,但仍低于正常對照組 (P＜0.05)。見表1。

表1 動物Tarlov評分、空洞前狀態中上頸髓凋亡細胞、Bcl-2和Bax陽性細胞數百分比及胞質和胞膜PKC活性變化 (n=8,x ±s)

圖1 不同時間點上頸髓水腫程度(HE,×400)

圖2 術后7 d光鏡下細胞改變(×400)

3 討 論

凡與細胞增殖有關的原癌基因及抑癌基因都參與了對細胞凋亡的調控。研究較多的主要有 Bcl-2、c-myc、p53、fas/apo-1等。Bcl-2家族包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-1、Bcl-X和促進凋亡的 Bax、Bak、Bcl-xs、Bik等,其中,Bcl-2是細胞凋亡的抑制基因,具有保護神經細胞抵抗多種損傷和抑制細胞凋亡的作用。Bax是與 Bcl-2密切相關但功能相反的一組基因,它與Bcl-2以同源或異源二聚體形式發揮作用,參與細胞凋亡的進程。本實驗提示機體試圖上調靶基因Bcl-2抑制凋亡發生,但隨著病情進展,結果是Bcl-2上調能力有限,反而促進細胞凋亡的Bax表達大大增加,明顯高于Bcl-2,最終導致細胞凋亡。

本研究結果還發現,胞膜PKC活性于術后第1天開始增高,第7～14天達到最高點,21 d有所回落,胞質PKC活性則出現相反變化趨勢,即PKC出現了轉位激活。眾所周知,PKC激活主要由第二信使二酰基甘油(DG)、磷脂酶D(PLD)和磷脂酶A2(PLA2)完成,其中前者對PKC激活是短暫的,而后兩者對PKC的激活是持續性的。因此推測脊髓空洞前狀態脊髓組織的PKC激活可能是由于Kaolin注入枕大池后,直接壓迫或(和)其導致的無菌性蛛網膜炎累及脊髓前后動脈、靜脈,造成脊髓缺血、水腫、生物膜去極化:①引起多種神經遞質如興奮性氨基酸、乙酰膽堿的釋放,這些遞質與其相應的受體作用通過G蛋白介導機制,激活磷脂酶C(PLC),從而使DG增加,DG直接激活PKC,而 PKC的激活反過來又可激活 PLA2和 PLD,而PLA2和 PLD又參與 PKC持續激活,形成惡性循環〔7〕;②脊髓損傷后細胞內Ca2+積聚可激活PLA2和 PLD,參與PKC持續激活,后者還促使細胞外 Ca2+內流,進一步激活PKC。

PKC是一種廣泛分布于哺乳動物真核細胞的鈣/磷依賴性激酶,在靜息狀態下以無活性形式存在于胞質中,激活后轉位于細胞膜,通過磷酸化作用,在信號傳導過程中充當第二信使,具有促進神經遞質釋放、突觸塑形、細胞增生、基因表達等作用。近年來,它在細胞凋亡中的作用日益突出。本研究提示PKC活化引起了一系列下游事件,可能通過信號轉導過程而調節Bcl-2和Bax表達,參與了脊髓空洞前狀態神經細胞的凋亡。Sitailo〔8〕在人類角化細胞的研究中證實PKC轉位激活能夠增加Bax表達,導致細胞凋亡。李云峰〔9〕在腦缺血再灌注模型中發現隨著PKC活性持續增加,Bcl-2表達也增高,提示了機體的抗凋亡作用。PKC是一種磷酸化蛋白,BCl-2一級結構有7個絲氨酸殘基,PKC可使之磷酸化,從而活化Bcl-2,使之發揮抑制凋亡的作用。然而,PKC作為第二信使和第三信使之間的橋梁,還可以通過核因子-κB將胞質的信號傳入核內,從而促進Bax的表達,促使細胞凋亡。總之,在實驗性脊髓空洞前狀態發病過程中,由于PKC的轉位激活,通過直接或間接途徑,上調Bcl-2和Bax表達,但 Bax表達顯著高于 Bcl-2,導致了神經細胞的凋亡。

1 孫國柱,張慶俊,李建峰,等.實驗性脊髓空洞前狀態病理學演變和意義〔J〕.中華實驗外科雜志,2006;23(12):1444-6.

2 Sgado P,Alberi L,Gherbassi D.Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(41):15242-7.

3 Nakaya K,Hasegawa T,Flickinger JC,et al.Sensitivity to radiation-induced apoptosis and neuron loss declines rapidly in the postnatal mouse neocortex〔J〕.Int J Radiat Biol,2005;81(7):545-54.

4 孫國柱,張慶俊,張更申.實驗性脊髓空洞前狀態神經元凋亡及 NF-κB,Bcl-2和Bax的調控作用〔J〕.第四軍醫大學學報,2006;27(5):416-9.

5 Bright R,Mochly-Rosen D.The role of protein kinase Cin cerebral ischemic and reperfusion injury〔J〕.Stroke,2005;36(12):2781-90.

6 張慶俊,孫國柱,張更申.實驗性家兔脊髓空洞癥發病機制研究〔J〕.中華神經外科雜志,2000;16(6):364-6.

7 陳康寧,董為偉 .蛋白激酶C和腦缺血損害〔J〕.國外醫學·內科學分冊,1996;23(4):164-7.

8 Sitailo LA,Tibudan SS,Denning MF.Bax activation and induction of apoptosis in human keratinocytes by the protein kinase Cdelta catalytic domain〔J〕.J Invest Dermatol,2004;123(3):434-43.

9 李云峰,陳康寧,鄭彩梅.大鼠腦缺血再灌注與蛋白激酶C活性變化及FOS、BCL-2的表達〔J〕.臨床神經病學雜志,2000;13(1):3-6.