HPLC法測定麻仁膠囊中大黃素及大黃酚的含量*

金 鑫，曲 佳，李時放

(1.天津市中心婦產科醫院，天津 300052； 2.天津市藥品檢驗所，天津 300070)

麻仁膠囊由熟大黃、火麻仁、苦杏仁、枳實、厚樸、白芍共6味中藥組成，具有潤腸通便的功效，用于腸燥便秘等癥。處方中大黃具有瀉熱通腸，涼血解毒，逐瘀通經等功效，原質量標準收載于中華人民共和國衛生部部標準WS3-41(X-32)-93(Z)，其中無含量測定，故采用HPLC法，以大黃素、大黃酚為定量指標，建立了處方中大黃的含量測定方法。修訂后的質量標準方法簡便、準確、專屬性及重現性好，可用于麻仁膠囊的質量控制。

1 儀器與試藥

日本SHIMADZU LC-2010CHT高效液相色譜儀，LC-solution工作站。大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號1100756-200110，為含量測定用)；大黃酚對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號110796-200615，為含量測定用)。麻仁膠囊(規格：0.35 g/粒，批號061001、061002、061201、070101、070201、071201、080101、080102、080301、080401)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱為Sepax Sapphire-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測波長為254 nm；流動相：甲醇-0.1 %磷酸溶液(85∶15)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；理論板數按大黃素峰計算為13 716，分離度為5.5。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 分別取大黃素、大黃酚對照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液制成每1 ml含大黃素10 μg、含大黃酚15 μg的混合溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取“裝量差異”項下的本品內容物，研細，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 ml，蒸干，殘渣加鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按處方配比，取除大黃外的其他藥材，按處方工藝制成制劑，再按“2.2.2”項下方法制得陰性對照溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析。結果陰性對照樣品在大黃素、大黃酚相應的保留時間處未見色譜峰。結果表明，陰性對照樣品對檢測無干擾，結果見圖1。

2.3線性關系考察 分別取大黃素、大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含大黃素分別為0.00075525、0.0015105、0.00377625、0.0075525、0.01132875、0.015105、0.01888125 mg，還分別含大黃酚為0.001578、0.003156、0.00789、0.01578、0.02367、0.03156、0.03945 mg的混合溶液，作為儲備液，分別精密吸取上述7種濃度的對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，求得回歸方程：Y大黃素=4.0×106X-4.8×102(r=1.000 0)；Y大黃酚=5.4×106X-5.2×102(r=1.000 0)。結果表明大黃素在0.007 552 5～0.188 812 5 μg范圍內線性良好；大黃酚在0.015 78～0.394 5 μg范圍內線性良好。

1.大黃素 2.大黃酚

2.4精密度試驗 取同一批號(071201)樣品內容物，研細，取1份，按照“2.2.2”方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，連續進樣6次，測定樣品中大黃素、大黃酚的峰面積，結果大黃素峰面積值的RSD為0.1%；大黃酚峰面積值的RSD為0.1%。

2.5重復性試驗 取同一批號(071201)樣品內容物，研細，取6份，按照“2.2.2”供試品溶液制備方法操作，按“2.1”色譜條件分析，測定每份樣品中大黃素、大黃酚的含量。結果6份樣品中大黃素的平均含量為2.3597 mg/g，RSD為2.9%；大黃酚的平均含量為5.6964 mg/g，RSD為1.1%，表明本方法重復性良好。

2.6穩定性試驗 取同一批號(071201)樣品內容物，研細，取1份，按照“2.2.2”供試品溶液制備方法操作，按“2.1”色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、10、12 h測定樣品中大黃素、大黃酚峰面積，結果大黃素峰面積值的RSD為0.3%；大黃酚峰面積值的RSD為0.1%。結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7回收率試驗 取同一批號(071201)樣品內容物，研細，取0.35 g，共6份，精密稱定，分別精密加入每1 ml含大黃素對照品0.023 62 mg、含大黃酚對照品0.057 44 mg的混合對照品甲醇溶液50 ml，再按照“2.2.2”項下供試品溶液制備操作，制得供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，計算回收率，結果大黃素平均回收率為99.58%，RSD為0.74%；大黃酚平均回收率為98.98%，RSD為1.83%，結果見表1和表2。

表1 大黃素加樣回收試驗測定結果(n=6)

表2 大黃酚加樣回收試驗測定結果(n=6)

2.8樣品測定 取10個批號的樣品，按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，測定樣品中大黃素、大黃酚的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 討論

3.1波長的選擇 通過對大黃素對照品溶液在200～400 nm處進行紫外光譜掃描檢測顯示，大黃素、大黃酚在254 nm處有最大吸收，與文獻[1]采用的波長基本相同。

3.2提取方法的選擇

3.2.1提取方式的選擇 取“裝量差異”項下同一批號(071201)樣品內容物，研細，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱重，分別采用超聲處理與加熱回流的方式，提取時間均為45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 ml，蒸干，殘渣加鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。結果顯示，提取溶劑為甲醇，采用加熱回流方式(7.969 2 mg/g)高于超聲處理方式(6.576 0 mg/g)，故將提取方式定為加熱回流。

3.2.2提取溶劑用量的選擇 取“裝量差異”項下同一批號(071201)樣品內容物，研細，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇25、50、100 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 ml，蒸干，殘渣加鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，測定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和。加入25.50、100 ml甲醇提取后大黃素和大黃酚含量之和分別為7.765 0、7.931 5和7.597 1 mg/g。結果顯示，加入甲醇50 ml高于其他兩種溶劑量，故將提取溶劑量定為50 ml，可將所測成分提取完全。

3.2.3提取時間的選擇 取“裝量差異”項下同一批號(071201)樣品內容物，研細，精密稱取0.7 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱重，分別加熱回流15、30、60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 ml，蒸干，殘渣加鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，測定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和。結果15、30、60 min提取的大黃素和大黃酚的含量之和分別為7.440 2、7.469 3和7.494 4 mg/g。30 min與60 min測定結果的相對平均偏差為0.17%，認為30 min提取時間可行，故將提取時間定為30 min。結果見表9。

3.2.4提取酸度的選擇 取“裝量差異”項下同一批號(071201)樣品內容物，研細，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 ml，蒸干，殘渣分別加鹽酸-30 %乙醇溶液(1∶10)、(3∶10)混合溶液各15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，測定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和。結果顯示，采用鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液(7.609 7 mg/g)高于(1∶10)的混合溶液(7.383 5 mg/g)，故將提取酸度定為(3∶10)，可將所測成分提取完全。

3.2.5酸水解時間的選擇 取“裝量差異”項下同一批號(071201)樣品內容物，研細，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 ml，蒸干，殘渣加鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液各15 ml，置水浴中分別加熱水解30、50、90 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯-無水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，測定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和酸水解30、50和90 min，樣品中大黃素和大黃酚的含量之和分別為7.609 7、7.853 1和7.977 3 mg/g。結果顯示，酸水解50 min與90 min，提取大黃素與大黃酚總量基本一致，二者RAD為0.78%，故將酸水解時間定為50 min，可將所測成分提取完全。且采用三氯甲烷萃取5次后，已將大黃素、大黃酚萃取完全。

3.3耐用性試驗

3.3.1不同色譜柱對含量測定的影響 取批號為071201的樣品，制成供試品溶液，分別用Sepax Sapphire-C18、Phenomenex-C18色譜柱，采用SHIMADZU-LC-2010CHT高效液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件，測定樣品中大黃素、大黃酚含量之和分別8.060 2和8.153 3 mg/g，二者RAD為0.09%。

3.3.2不同儀器對含量測定的影響 取批號為071201的樣品，制成的供試品溶液，用色譜柱，分別采用SHIMADZU-LC-2010CHT與SHIMADZU LC-2010C高效液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件分析，測定樣品中大黃素、大黃酚含量之和分別為8.060 2和7.943 0 mg/g，二者RAD為0.73%。結果顯示，采用相同儀器，不同色譜柱，與采用相同色譜柱，不同儀器對測定結果均無影響。因此，建立的該含量測定方法耐用性良好，具有可行性。

1 中國藥典.一部.2005：603