預處理星形膠質細胞GDNF神經元保護機制研究

李昕華

(胥桂華長春市中心醫院神經內科 長春 130000)

研究發現星形膠質細胞可通過上調其培養基(Astrocyte medium,AM)中的營養因子發揮腦保護作用,從而減輕缺血、缺氧對神經元造成的損害[1]。AM經離心、過濾后可制成條件培養基(Astrocyte conditioned medium,ACM),用于細胞培養,以判斷營養因子的作用。本實驗給予星形膠質細胞不同處理后制備ACM,通過不同ACM對缺氧神經元凋亡的影響,探討預處理星形膠質細胞GDNF腦保護作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

出生12hWistar大鼠:皮層神經元原代培養;出生1～2d Wistar大鼠:星形膠質細胞原代培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經元和星形膠質細胞原代培養 采用酶消化法結合機械分離法。

1.2.2 制備缺氧預處理細胞模型 將培養第6天的神經元和第9天的星形膠質細胞放入厭氧培養箱孵育,取孵育30、90min作為預處理及缺氧時間,給予神經元不同處理后分成3組:對照組

(control)、預處理+缺氧組(IPC+HY)、缺氧組(HY)。

1.2.3 制備ACM ACM1為正常AM,ACM2為預處理及再缺氧后GDNF高表達的AM,ACM2加入GDNF抗體中和后即為ACM3。

1.2.4 檢測神經元凋亡 分別用3種ACM孵育3組神經元,培養24h后,采用AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術(FCM)檢測神經元凋亡。

表1 流式細胞術檢測神經元凋亡率[n=36,%,(±s)]

表1 流式細胞術檢測神經元凋亡率[n=36,%,(±s)]

注:*P<0.05 compared with control group,#P<0.05 compared with HY group, △P<0.05 compared with ACM1 and ACM3 group

ACM1 ACM2 ACM3 control 4.28±0.27 5.31±0.58 5.63±0.49 IPC+HY (40.38±0.74)*# (26.34±0.52)*#△ (46.15±1.09)*#HY (52.13±0.64)* (41.62±0.67)* (55.34±1.11)*

1.3 統計學分析

2 結果

不同ACM對正常對照組神經元凋亡率無影響(P>0.05)。正常對照組早期神經元凋亡率明顯低于另外2組(P<0.05),預處理+缺血組神經元用ACM2孵育后凋亡率低于ACM1及ACM3組(P<0.05),結果見表1。

3 討論

在腦組織缺血過程中星形膠質細胞發揮重要作用,通過分泌營養因子和攝取離子等方式發揮腦保護機制[2],在缺血時如何減輕神經元凋亡是腦保護的難題[3],本實驗用厭氧培養箱孵育神經元和星形膠質細胞,模擬中樞神經系統缺血預處理及再缺血過程,用不同ACM培養受損神經元,建立體外星形膠質細胞/神經元相互作用體系,用AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測神經元凋亡,說明缺氧預處理誘導星形膠質細胞GDNF表達增加,阻止神經元早期凋亡的發生。

[1]Dienel GA, Hertz L. Astrocytic contributions to bioenergetics of cerebral ischemia[J].Glia.2005,50:362～388.

[2]Lee SH, Kim M, Yoon BW,et al.Targeted hsp70 disruption increases infarction volume after focal cerebral ischemia in mice[J].Stroke,2001,32(12):2905～1912.

[3]Le DA,Wu Y,Huang Z,et al.Caspase activation and neuroprotection in caspase-3 deficient mice after in vivo cerebral ischemia anti in vitro oxygen glucose deprivation[J].Proc Nail Acad Sci USA,2002,99:15188～15193.