花椰菜新品種浙801雜交種純度的SSR鑒定

趙振卿，盛小光，虞慧芳，王建升，張曉輝，顧宏輝

（浙江省農業科學院蔬菜研究所，杭州，310021）

我國是花椰菜生產大國，也是花椰菜種子生產大國，培育、生產的花椰菜種子不僅在國內廣泛種植，而且大量出口國外。種子純度是評價種子質量的關鍵，也是種子產業的命脈。傳統的種子純度鑒定方法是以播種后植株的田間形態觀察為依據，其周期長、工作量大，且易受環境、季節因素影響，導致結果存在偏差。因此，開發快速、準確的種子純度鑒定方法已成為種子科研單位和企業共同關注的課題。

SSR標記技術可以通過檢測待鑒定樣品是否具有某一品種的基因特異片段來辨別其真偽，從而對種子純度進行檢測，具有快速、準確、穩定、安全、不受環境因素影響等優點。目前，SSR標記已被廣泛應用于水稻、棉花等作物的雜交種純度鑒定[1~4]，在甘藍中也有應用[5，6]，而在花椰菜中尚未見報道。

浙801是浙江省農業科學院蔬菜研究所利用小孢子培養技術選育的中熟花椰菜新品種，通過自交不親和系繁制的雜交一代商品種。本文通過篩選浙801特異的SSR片段，建立了鑒定浙801雜交種純度的SSR標記技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為花椰菜品種浙801雜交種及其父本和母本，由浙江省農業科學院蔬菜所提供。

SSR引物序列來自于http://www.brassica.info，由Invitrogen公司合成，SSR分析所用到的其他分子生物學試劑均購自北京鼎國生物技術公司。

1.2 試驗方法

①播種與取樣 浙801雜交種及其父本和母本于2009年夏季播種，每份材料各種植20株，在成熟期經田間形態鑒定后，采集較嫩葉片，于-70℃保存，用于SSR引物的篩選分析；2010年種植制種田生產的待檢測的浙801商品種200株，分單株編號，于3~4葉期采集葉片，用于雜種純度的鑒定試驗。

②總DNA的提取 所有材料的DNA均采用CTAB法小量提取，參考Doyle[7]的方法，略加修改。

③SSR分析 SSR的PCR擴增總體積為10 μL，反應體系如下：1×擴增緩沖液，2 mmol/L的 MgCl2，0.2 mmol/L 的 dNTPs，0.5 U Taq酶，2.5 mmol/L 的引物，模板 DNA 50 ng，加 ddH2O 至終體積 10 μL，反應在東勝龍熱循環擴增儀上進行。熱循環程序為：94℃預變性 2 min，1 個循環；94℃變性 1 min，60℃復性 30 s，72℃延伸45 s，10個循環，循環 1次復性溫度降低 0.5℃；94℃變性 1 min，55℃復性 30 s，72℃延伸 45 s，30個循環；4℃保存。

SSR擴增產物在6%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，顯影采用簡易銀染法[8]。

2 結果與分析

2.1 浙801雜交種特異帶型的篩選

對2009年播種的浙801雜交種及其父本和母本分別于苗期、蓮座期、現球期和收獲期進行了田間性狀的考察，通過株形、葉形、蠟粉、生育期以及花球形態等多方面的綜合評價，確定所有供試材料均未出現異型株。

利用SSR引物直接對供試材料進行了篩選，發現引物YP64可以將浙801雜交種與其父母本區分開來（圖1）。重復試驗表明，此特異片段穩定性和重復性良好。

2.2 浙801雜交種純度的田間鑒定

對2010年播種的200株浙801商品種以同樣方法進行田間鑒定。苗期發現異型株2株，為147號和161號?，F球期發現異型株5株，為59號、72號、147號、155號和169號。收獲期的調查結果與現球期的一致。最終確定59號、72號、147號、155號和169號為異型株，該批雜交種的純度為97.5%。

在異型株中，59號、72號、155號和169號表現為母本表型，推測其是由母本自交所產生；147號表現為父本表型，可能是在制種田收獲雜種時誤收了少量父本。

2.3 浙801雜交種純度的SSR鑒定

利用SSR引物YP64對200株浙801商品種及其雙親的DNA進行PCR擴增，群體中共有195個單株擴增出雜交種帶型（圖1），有4株擴增出母本帶型（59號、72號、155號和169號），有1株擴增出父本帶型（147號），雜種純度為97.5%，與2.2結果一致。

圖1 SSR引物YP64在浙801雙親、雜交種中擴增的電泳檢測M：Marker；1：母本；2：浙 801 手工雜交種；3：父本；4～23：141 號～160號浙801商品種，其中10和18分別為異型株147號和155號。

3 小結與討論

長期以來，育種家們已積累了多種雜種純度鑒定的方法。如通過調查雜種F1代的育性來判斷三系配套生產的雜交種的真偽，但這種方法只能識別出雄性不育系因受溫度、光照等因素影響產生微量花粉而自交產生的假雜種，其他來源的假雜種則無法識別。浙801雜交種是通過自交不親和系繁育的，若要鑒定雜交種的純度，只能以正常季節種植的F1群體中各單株的外形特征為依據進行判斷，因為非正常季節種植的花椰菜外形特征變化很大。此外，外形鑒定法需結合各個時期的性狀來綜合判斷，耗時幾個月，而SSR標記來檢測雜種純度則不受播種季節的限制，發芽后采集子葉抽提DNA即可，只需7~10 d就可完成。

本試驗篩選出了共顯性SSR標記YP64，用于檢測浙801商品種的純度，并與田間性狀調查的鑒定結果進行了比較。最終結果表明，SSR標記鑒定的結果與田間鑒定是一致的，而且結果更加客觀、可信。本試驗中的SSR引物可以明確地檢測出母本自交、父本誤收因素造成的雜交種混雜，但不能鑒定出由異源花粉污染或機械混雜等造成的異型株。事實上，若采取嚴格的隔離措施，由后2種因素造成浙801商品種混雜的可能性幾乎為零。

下一步研究需要擴大篩選的范圍，利用SSR標記構建花椰菜種質資源和育種材料的DNA指紋圖譜，從而通過某1對或多對引物的組合區分任意品系或品種。指紋圖譜的構建不僅將對雜交種純度鑒定提供技術支撐，而且在品種權保護等方面具有重要意義。

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