佳美苦瓜純度的SRAP鑒定

許端祥，高山，林碧英，傅睿清

（福建福州市蔬菜科學研究所，350111）

苦瓜（Momordica charantiaL.）為葫蘆科苦瓜屬一年生攀緣草本植物，起源于東南亞的熱帶地區，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區，在中國、印度、日本、東南亞都有悠久的栽培歷史。佳美苦瓜是福州市蔬菜科學研究所繼佳玉苦瓜[1]之后培育的苦瓜新品種，其母本是強雌系43-C，父本為自交系59-W。佳美苦瓜植株生長勢強，分枝力強，早中熟，主蔓第一雌花著生8~12節，雌花率高；從開花到商品瓜成熟需15~20 d，商品瓜呈長棒形，尾部鈍圓，瓜長26~35 cm，橫徑5~7 cm，肉厚1.1 cm；瓜皮色綠有光澤，瓜面圓瘤與短縱瘤相間，瓜形美觀，成熟瓜不褪綠，肉質甘脆微苦，品質優良，單瓜質量400~500 g，667 m2產量3 000 kg左右。目前已在福建、廣東、湖北、四川等地示范推廣，表現反映良好，種植面積不斷擴大。

隨著種植面積的擴大，其用種量逐步增大，種子質量的控制就顯得尤為重要。種子純度是種子質量的主要指標，種子純度的降低會明顯降低作物的產量和產品品質。目前國內外對農作物品種的純度鑒定仍以形態指標鑒定為主，其特點是準確可靠，但檢測周期長，不能滿足當年用種需要。為縮短鑒定周期，同工酶技術已應用于瓜類蔬菜雜種純度的鑒定[2，3]，但同工酶多態性不夠豐富，同時有組織和器官特異性，大大降低了鑒定結果的穩定性和準確性。隨著分子生物學的快速發展，以PCR為基礎的DNA 分子標記技術如RAPD，SCAR，SSR，ISSR等得以發展與應用。其中SRAP（sequence related amplified polymorphism）是一種新型的分子標記技術，其操作簡便，無需預先知道基因組信息，且具有豐富的多態性[4]。

本研究以佳美苦瓜及其親本為材料，采用SRAP分子標記技術，建立佳美苦瓜及其親本的DNA指紋圖譜，為其純度鑒定和知識產權保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦瓜品種佳美及其親本均由福州市蔬菜科學研究所苦瓜課題組提供。采用穴盤育苗，待幼苗長到2片真葉時取嫩葉待用。SRAP引物、Taq酶和dNTP等購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 試驗方法

①DNA提取 以幼苗為材料，隨機抽取苦瓜品種佳美及其父母本各20株，剪取剛展開的健康嫩葉，于液氮中研磨，采用改良的CTAB法[5]提取總DNA，用紫外分光光度計在260nm和280nm下測定OD值，檢測DNA的質量和濃度，并將其稀釋到30 ng/μL作為PCR擴增的模板。

②PCR擴增 擴增反應在PCR（Eppendorf Mastercyclergradient）儀上進行。SRAP反應參照Li等[4]的方法進行。對9個上游引物（Me1~9）和12個下游引物（Em1~12）組成的108對引物進行擴增篩選。25 μL的反應體系為：30 ng/μL DNA 模板，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L 引物，0.75 U Taq酶。擴增程序為：94℃預變性 5 min；94℃變性 1 min，35℃復性 1 min，72℃延伸 1 min，5 個循環；94℃變性1 min，50℃復性 1 min，72℃延伸 1 min，35 個循環；72℃ 10 min，4℃保存。

2 結果與分析

2.1 特征引物的篩選

按Li等[4]提出的原則設計引物，選用上海生工生物工程有限服務公司合成的SRAP的9個上游引物（Me1~9）和 12 個下游引物（Em1~12）組成的 108 個引物組合對材料進行擴增篩選。隨機提取佳美的父本、母本及F1代植株各20株，建立混合池，其中有2對引物擴增的雜種譜帶與父本有差異；有2對引物擴增的雜種譜帶與母本有差異。

2.2 指紋圖譜的建立

經多次試驗，篩選出2對特征引物Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）（圖 1）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'）（圖 2），建立了佳美苦瓜的DNA指紋圖譜。篩選的2對特征引物能同時擴增出F1代及其父母本的多態性條帶，其擴增產物具有高度的穩定性和重復性。

圖2 引物Me8-Em8佳美苦瓜和父母本基因組DNA的SRAP擴增

圖1 引物Me6-Em9佳美苦瓜和父母本基因組DNA的SRAP擴增

2.3 雜種純度的鑒定

將佳美雜交種種植于大田中，待幼苗長至2片真葉時，隨機抽取100株單株并編號，按上述方法提取 DNA，選用 2 對特征引物 Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'）進行SRAP的分子鑒定。結果檢測出3株單株無父本特異帶只有母本特異帶，說明這3株植株是母本苗，雜交種的純度為97%。成株期鑒定植株的生物學性狀，發現3株與母本性狀一樣，雜交率為97%，與SRAP鑒定結果一致。

3 小結

本試驗通過優化DNA提取程序，嚴格控制DNA模板質量，優化反應體系。經多次試驗，篩選出2對特征引物 Me6（5'-BAAG-3'）-Em9（3'-DCAG-5'）、Me8（5'-BACT-3'）-Em8（3'-DTGC-5'），建立了佳美苦瓜的DNA指紋圖譜。在生產田中隨機抽取單株并編號，苗期提取DNA進行SRAP分子鑒定，試驗結果與大田植株成株期的形態鑒定結果高度吻合，說明利用SRAP分子技術建立DNA指紋圖譜鑒定佳美品種的純度是可行的。

[1]高山，林碧英，許端祥，等.苦瓜新品種佳玉的選育[J].中國蔬菜，2010（18）：89-90.

[2]孟祥波，張鳳麗.同工酶技術在瓜類蔬菜上的應用研究[J].上海蔬菜，2010（1）：19-20.

[3]閆世江，張繼寧，劉潔.同工酶技術在瓜類育種中的應用[J].蔬菜，2010（8）：33-35.

[4]Li G,Quiros C F.Sequence related amplified polymorphism(SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103(2):455-461.

[5]王關林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學出版社，2002：742-744.