瘦素對L-02肝細胞甘油三酯沉積及乙酰輔酶A羧化酶表達的影響

周紅宇，陽學風

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種肝組織學改變的臨床病理綜合征，與酒精性肝病相類似，但與飲酒無明確關系。根據其病理學改變及臨床表現，分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化［1］。肝臟所含脂質絕大部分為甘油三酯，各種致病因素均可導致肝細胞內甘油三酯(TG)異常堆積，從而導致FLD的發生。

瘦素是肥胖基因(Obese gene)編碼的蛋白產物，受體廣泛分布于脂肪、骨骼肌、肝臟、心、肺、胰、卵巢、睪丸等組織。瘦素通過與受體結合發揮作用［2］，調節機體脂肪的穩定，抑制食欲、增加能耗和減少體重可能是瘦素的主要作用。本文以人肝L-02脂肪變細胞模型，通過油紅“O”染色、RTPCR等方法，對瘦素作用后的脂肪變細胞進行研究，了解瘦素與NAFLD的關系，并初步探討瘦素對其的治療作用。

1 實驗方法

1.1 非酒精性脂肪變肝細胞模型的建立 人肝L-02細胞株培養接種于50mL培養瓶中，在含體積分數10%的滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的 1640完全培養基中，于37℃，5%CO2培養，飽和濕度，貼壁生長。待細胞長滿80%瓶底，消化液消化傳代。在更換新鮮培養液后加入胎牛血清，使其濃度為50%，繼續培養24 h，形成非酒精性肝細胞脂肪變性模型。

1.2 造模是否成功的判斷 Lillie氏油紅-O染色:將細胞培養于有無菌蓋玻片的6孔培養板，用PBS沖洗蓋玻片5min(×3次)，50%異丙醇固定1min，油紅“O”染色10min，蒸餾水沖洗1min(×3次)，蘇木素染色5min，分色和返藍后，HPIAS-1000型圖像分析系統收集圖像。

1.3 RT-PCR法檢測人肝L-02乙酰輔酶A羧化酶(ACC)mRNA的表達 以 lμg逆轉錄產物(cDNA)為模板，通過半定量RT-PCR，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參照。

2 結果

2.1 人肝L-02細胞脂肪化 正常細胞(圖1)用50%胎牛血清培養基培養24 h后，用油紅“O”染色，顯微鏡下觀察，細胞漿內有大量脂滴存在，符合脂肪化肝細胞特點(圖2)。

圖1 正常肝細胞(油紅‘O’×400)

圖2 模型組(油紅‘O’×400)

2.2 不同瘦素劑量干預后脂肪化人肝L-02細胞的變化 脂肪化人肝L-02細胞分別用10－7mol/L、10－6mol/L、10－5mol/L 瘦素 +1640 完全培養基培養24 h后，用油紅“O”染色，顯微鏡下觀察，脂肪化程度逐漸減輕，見圖3～圖5。

圖3 模型組+瘦素10－7mol/L組(油紅‘O’×400)

圖4 模型組+瘦素10－6mol/L組

2.3 瘦素對人肝L-02脂肪變細胞乙酰輔酶A羧化酶mRNA表達的影響 用RT-PCR檢測人肝L-02細胞乙酰輔酶A羧化酶mRNA的表達。結果顯示，經瘦素處理的人肝L-02細胞乙酰輔酶A羧化酶mRNA的表達與瘦素呈濃度依賴性遞減。模型組、10－7mol/L、10－5mol/L 及10－5mol/L 瘦素處理組目的基因及GAPDH基因灰度值比值分別為0.867、0.745、0.642、0.512，正常組及正常細胞加瘦素組分別為0.460及0.437，見圖6。瘦素處理組與模型組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖5 模型組+瘦素10－5mol/L組

圖6 不同濃度瘦素處理對人肝L-02脂肪變細胞ACCmRNA表達的影響(灰度值)

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高，飲食結構的變化，檢測手段的提高，非酒精性脂肪肝(NAFLD)發病率呈逐年上升趨勢。自1994年起，一系列研究結果表明，NAFLD的發病無性別差異，在非肥胖和糖尿病人群中也有較高的發病率。特別是發現NAFLD可進展至肝炎、肝纖維化和肝硬化之后［3-4］，逐漸為人們所重視。約75%的2型糖尿病患者可發生不同形式的NAFLD;70%的肥胖患者發生脂肪肝，其中18%出現 NASH［5］。NAFLD的發病機制尚不十分清楚，人們廣泛認同Day等［6］提出的“二次打擊”理論。多因素聯合作用誘發胰島素抵抗(IR)，后者通過增加脂肪分解和FFAs轉運至肝臟導致第一次打擊—脂肪肝形成，并造成肝臟對第二次打擊的敏感性增強。氧應激、脂質過氧化等進一步促進IR，加重氧應激和肝細胞損傷，導致炎癥反應、肝細胞變性和肝纖維化，即第二次打擊。本研究結合文獻方法［7］，用高脂培養基造模，形成典型的非酒精性脂肪肝細胞模型，主要研究NAFLD形成的第一步肝細胞內脂肪沉積及瘦素干預后的變化。

肝臟是體內參與脂質代謝的重要場所。肝臟脂質代謝穩態的變化是構成各種形式脂肪肝的基礎，各種致病因素可通過一個或多個環節導致肝細胞內TG異常堆積。肝細胞不能儲存脂肪，TG在肝細胞內，一方面氧化分解供能，另一方面與載脂蛋白B100、載脂蛋白C等以及磷脂、膽固醇結合生成極低密度脂蛋白(VLDL)，由肝細胞分泌通過血液循環運輸至肝外組織。當肝細胞合成TG增多，TG轉運或氧化障礙時，均可導致TG的堆積，形成脂肪肝。

本實驗發現肝細胞普遍發生脂肪變性，細胞腫脹，內含較大的脂肪滴，可將細胞核擠壓向胞膜，表明高脂環境可引起肝臟脂肪浸潤(TG貯存)。而經過瘦素處理后，肝細胞內脂滴明顯減少，細胞形態恢復正常，與瘦素呈劑量依賴性關系。說明10－7～10－5mol/L濃度的瘦素對離體脂肪變肝細胞有積極的防治作用。

瘦素是一種主要由白色脂肪組織分泌合成、由167個氨基酸殘基組成的蛋白質類激素［8］。主要在白色脂肪組織中表達，通過靶細胞膜上的受體及相應的信號轉導體系發揮作用。OB-Rb主要存在于下丘腦中能表達NPY的細胞表面，與瘦素結合后，通過Janus激酶(JAK)以及信號轉導和轉錄激活物(STAT)蛋白發揮信號轉導作用，調控核內DNA上leptin效應基因的轉錄活性。瘦素與特異性運輸蛋白結合，通過血腦屏障后與下丘腦特異受體結合，把體脂信號傳遞給下丘腦。下丘腦再通過一系列神經體液因素調節機體能量代謝，調整體脂，控制體重相對恒定［9］。給OB小鼠腦脊液中注入瘦素后［10］，進食明顯減少，體重逐漸下降，減少的僅為脂肪組織，且基礎代謝率有所升高，說明抑制食欲、增加能耗和減少體重可能是瘦素減肥的主要機制。

瘦素可能從外周直接拮抗肝脂肪變性。瘦素可以激活AMP活化蛋白激酶，減少脂肪沉積［11］，還可特異性抑制肝臟的硬脂酰基-輔酶A去飽和酶，使肝臟 VLDL生成和脂肪沉積減少［12］。Unger等［13］認為，非脂細胞瘦素受體發生功能障礙時，細胞內TG含量能增加100倍，而持續表達的異位高瘦素血癥能使細胞內TG耗竭;瘦素還干預胰島素在肝臟中的作用，一方面拮抗胰島素誘導的PEPCK下調，抑制胰島素受體底物-1(IRS-1)的磷酸化，影響胰島素受體后信號轉導;另一方面，瘦素通過對PEPCK及糖異生的影響，限制TG的合成，提高肝臟及外周組織對胰島素的敏感性。Stumvoil等［14］發現，瘦素與脂聯素等連用，能促進小鼠肝脂肪燃燒及能量消耗，可逆轉缺乏過氧化物酶體增殖受體(PPAR)α的脂肪萎縮小鼠的胰島素抵抗。

本實驗證實細胞內TG明顯增加，經過瘦素處理后，肝細胞內TG明顯減少，與瘦素呈劑量依賴性關系。說明瘦素能明顯減少離體脂肪變肝細胞的TG沉積，與文獻［12-15］報道一致。本實驗顯示，瘦素對離體脂肪變肝細胞具有降低細胞內脂肪沉積的作用，對TG的作用明顯。同時，本實驗通過油紅“O”染色顯示，瘦素處理后脂肪變肝細胞內TG量明顯減少，瘦素可抑制乙酰CoA羧化酶的表達而抑制TG的合成，可見瘦素可使離體肝細胞內TG合成減少，減少TG沉積，從而減輕肝細胞脂肪化程度。但其對人類非酒精性脂肪性肝臟疾病是否具有治療意義，以及具體作用機制，有待進一步研究。

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