阿托伐他汀對(duì)CLP大鼠模型的保護(hù)作用

曲茂興，于 健*，李春樹，呂慧怡

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)，發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，是ICU患者死亡的主要原因之一［1］。阿托伐他汀是臨床常用的調(diào)脂藥，大規(guī)模臨床試驗(yàn)證明，它可顯著降低心血管疾病的致殘率和死亡率［2－5］，同時(shí)具有抗炎［6－11］、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能和NO活性等作用［12－14］。本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)建立膿毒癥大鼠模型，觀察阿托伐他汀對(duì)大鼠血漿一氧化氮(NO)和肝組織勻漿丙二醛(MDA)的影響，探討阿托伐他汀的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備 DS－88型電子秤(武漢自動(dòng)化儀表廠)，TG16WS高速臺(tái)式離心機(jī)(長沙科學(xué)儀器廠)，UV－2100 Spectrophotometer紫外/可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，XW－80A旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)，HH－W21－600電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

1.2 試劑和材料 阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):081128);一氧化氮(NO)，微量丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 75只健康雄性SD(Sprague－Dawley)大鼠，體質(zhì)量184～202 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)排列表法分為3組，每組25只。對(duì)照組用食用淀粉40 mg/kg加入2mL生理鹽水，制成混懸液，連續(xù)灌胃5 d，第6日行假手術(shù)。膿毒癥組同樣用食用淀粉灌胃，第6日行CLP，用絲線結(jié)扎盲腸總長度的30%［15］，在盲腸游離端選2個(gè)相距3mm點(diǎn)分別刺穿盲腸，術(shù)后置籠內(nèi)活動(dòng)，不禁飲食。阿托伐他汀組，用阿托伐他汀40 mg/kg［16］溶于2mL生理鹽水，制成混懸液，連續(xù)灌胃5 d，第6日行CLP。

1.4 標(biāo)本收集及檢測(cè) 分別在術(shù)后0、2、6、10、24 h時(shí)間點(diǎn)眼眶采血，肝素抗凝管靜置30min，4℃、3000 r/min離心15min，取血漿于－20℃冰箱中保存。剪取肝臟組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，濾干，稱濕重約0.1 g倒入玻璃勻漿管中，加入1mL 0.86%冷生理鹽水研磨，使組織勻漿化，4℃、2000 r/min離心15min，取上清于－20℃冰箱中保存。用分光光度計(jì)檢測(cè)血漿NO、肝臟組織勻漿MDA的含量。24 h時(shí)間點(diǎn)取心臟、肺、肝臟、空腸標(biāo)本，置10%甲醛溶液中固定，依次常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下檢查組織病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，正態(tài)分布變量多組間比較用方差分析，3個(gè)處理組均數(shù)的兩兩比較用LSD－t檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿NO的比較 2 h時(shí)對(duì)照組與膿毒癥組(P=0.029)和阿托伐他汀組(P=0.038)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。膿毒癥組在術(shù)后6 h明顯升高，24 h達(dá)到峰值(329.04±21.15)μmol/L;阿托伐他汀組在術(shù)后10 h明顯升高，在24 h達(dá)到峰值(209.53±10.68)μmol/L。在0 h和2 h時(shí)間點(diǎn)，阿托伐他汀組與膿毒癥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，在 6 h、10 h、24 h時(shí)間點(diǎn)，阿托伐他汀組與膿毒癥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖1。

圖1 各組血漿NO濃度的比較

2.2 各組肝組織勻漿MDA的比較 膿毒癥組和阿托伐他汀組MDA含量在術(shù)后2 h升高，6 h、10 h無明顯變化，于24 h再度回升并分別達(dá)到峰值(8.22±0.54)nmol/mgprot和(6.32±0.35)fnmol/mgprot。在 2 h、6 h、10 h、24 h，阿托伐他汀組MDA含量均低于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2。

圖2 各組肝組織勻漿丙二醛水平的比較

2.3 光學(xué)顯微鏡檢查 心臟:對(duì)照組無明顯病理改變或間質(zhì)血管充血(圖3A)。膿毒癥組部分心肌變性，血管充血明顯(圖3B)。阿托伐他汀組少量心肌變性，間質(zhì)血管充血(圖3C)。肺:對(duì)照組肺泡間隔無增寬，無炎性細(xì)胞浸潤(圖4A)。膿毒癥組肺泡間隔明顯增寬，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，其周圍炎細(xì)胞浸潤明顯(圖4B)。阿托伐他汀組肺泡間隔略增寬，少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(圖4C)。空腸:對(duì)照組腸粘膜正常(圖5A)。膿毒癥組腸粘膜部分上皮脫落，重度炎癥(圖5B)。阿托伐他汀組腸粘膜中度炎癥(圖5C)。肝臟:對(duì)照組無明顯病理改變或肝細(xì)胞輕度水腫，匯管區(qū)少量淋巴細(xì)胞浸潤(圖6A)。膿毒癥組肝細(xì)胞高度水腫、變性(圖6B)。阿托伐他汀組肝血管略充血，肝細(xì)胞水腫較輕(圖6C)。

3 討論

本次試驗(yàn)采用CLP復(fù)制膿毒癥大鼠模型［17－18］。CLP模型操作簡單，通過外科處理使動(dòng)物腹腔存在失活組織的同時(shí)，少量持續(xù)溢入混有多種細(xì)菌的腸內(nèi)容物，引起腹腔感染，與臨床上闌尾炎穿孔形成的憩室炎極為相似［19－20］，既可以使膿毒癥得到充分發(fā)展，也可以保證膿毒癥大鼠模型在24 h內(nèi)的存活率。進(jìn)入腹腔的細(xì)菌釋放，刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，可迅速活化不同組織器官的細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體代謝、激素水平和神經(jīng)內(nèi)分泌改變，造成細(xì)胞功能異常和器官功能衰竭。內(nèi)毒素也激活生理狀態(tài)下沒有活性的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)并大量表達(dá)，產(chǎn)生過量的NO，促使大量的中性粒細(xì)胞活化，引起“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生大量的氧自由基，促進(jìn)炎性滲出和組織損傷。MDA是體內(nèi)自由基代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可以反映脂質(zhì)過氧化自由基的存在及反應(yīng)的程度［21］。他汀類藥物能抑制iNOS的表達(dá)，下調(diào)NO的合成，從而改善膿毒癥的預(yù)后。

本次試驗(yàn)中，膿毒癥組血漿NO濃度在術(shù)后6 h顯著升高，24 h達(dá)到峰值(329.04±21.15)μmol/L。在阿托伐他汀干預(yù)后，血漿NO的濃度在術(shù)后10 h才顯著升高，術(shù)后24 h達(dá)到峰值(209.53 ±10.68)μmol/L。在6 h、10 h、24 h時(shí)間點(diǎn)，阿托伐他汀組大鼠血漿中NO的濃度較膿毒癥組明顯降低(P＜0.01)。阿托伐他汀可以降低膿毒癥大鼠血漿中NO的濃度。在膿毒癥組，術(shù)后24 h肝組織勻漿MDA含量的峰值為(8.22±0.54)nmol/mgprot，阿托伐他汀組為(6.32±0.35)nmol/mgprot，在術(shù)后 2 h、6 h、10 h、24 h，阿托伐他汀組肝組織勻漿MDA含量均低于膿毒癥組(P＜0.05或P＜0.01)，說明阿托伐他汀也可以降低膿毒癥大鼠肝組織勻漿中MDA的含量。與膿毒癥大鼠高濃度的NO和MDA相對(duì)應(yīng)，24 h后光鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組心臟﹑肺﹑肝臟﹑空腸有明顯病理改變，炎細(xì)胞浸潤，組織充血、壞死、滲出，表現(xiàn)為重度炎癥，提示膿毒癥時(shí)心臟﹑肺﹑肝臟﹑空腸都可能受累。阿托伐他汀干預(yù)后，心臟﹑肺﹑肝臟﹑空腸光鏡下的病理改變較膿毒癥組有一定程度的改善。說明阿托伐他汀可能減輕膿毒癥大鼠模型的炎癥反應(yīng)，因此，推測(cè)在膿毒癥患者中應(yīng)用他汀類藥物可能具有一定的臨床意義。

圖3 光學(xué)顯微鏡下大鼠心臟24 h病理改變(HE×400)

圖4 光學(xué)顯微鏡下大鼠肺臟24 h病理改變(HE×200)

圖5 光學(xué)顯微鏡下大鼠空腸24 h病理改變(HE×200)

圖6 光學(xué)顯微鏡下大鼠肝臟24 h病理改變(HE×200)

“拯救膿毒癥戰(zhàn)役”(SSC)會(huì)議推薦早期集束化治療:液體復(fù)蘇，血管活性藥物，控制血糖，小劑量激素，機(jī)械通氣以及重組人體活化蛋白 C(rhAPC)用于治療膿毒癥休克等，但目前仍沒有特效治療方法。雖然FDA批準(zhǔn)他汀類藥物僅作為調(diào)脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化使用，也許它的保護(hù)作用可以給我們新的啟發(fā)和思路。

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