針刺對抑郁癥睡眠障礙大鼠行為學和海馬5-羥色胺受體表達水平的影響?

甄君，范建中，姚曉黎，舒曉春，楊艷杰，孔梅

睡眠障礙是抑郁癥狀群的重要組成部分，是抑郁癥最早和最常見的癥狀之一，以入睡困難、睡眠不深及早醒為特征。睡眠障礙可加重抑郁癥的病情，延緩抑郁癥的康復進程。嚴重的抑郁癥睡眠障礙和自殺有關，而且對多種抗抑郁藥物治療反應差。在抑郁癥的治療中，不僅要關注抑郁癥狀的緩解，也應重視睡眠障礙的改善。抑郁癥睡眠障礙(sleep deprivation depression,SDD)的研究已成為人們關注的焦點。以往研究提示，5-羥色胺受體(5-HTR)參與人類情感、認知及感覺等行為，尤其是海馬5-HT1AR、5-HT2AR表達變化與抑郁睡眠障礙密切相關[1-2]。本研究觀察針刺對SDD大鼠海馬5-HT1AR、5-HT2AR的影響，以期為針刺治療SDD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康清潔級Wistar大鼠36只，體重200～250 g，雌雄各半(廣東省動物實驗中心提供，實驗動物批號：SCXK(粵)2008-0002)。

首先用Open-Field法[3]進行行為學評分，選擇得分相近的36只大鼠，適應性喂養1周后，隨機分為正常組、模型組與針刺組，每組12只。正常組每籠飼養6只，其余各組動物每籠1只孤養。

1.2 主要實驗儀器與試劑 BDC-280e超低溫冰箱：長沙伊來克斯；5417R型高速冷凍離心機：德國EPPENDORF公司；Real-time PCR檢測儀：7300Sequence Detection System ABI-7500，美國ABI公司；大鼠5-HT1A、5-HT2A、β-actin基因引物：上海生工生物技術有限公司合成；SYBRGreen PCR試劑盒：廣州達暉生物公司。

1.3 抑郁模型及睡眠剝奪干預 參考文獻[4]制作抑郁模型大鼠。除正常組外，其余各組每日隨機安排1種應激，包括：行為限制2 h、電擊足底(36 V交流電，每隔1 min刺激1次，每次刺激10 s，共30次)、冰水游泳(4℃，5 min)、熱應激(45℃，5 min)、搖晃(1/s，共15 min)、鼠籠傾斜45°24 h、夾尾1 min、禁水24 h、禁食48 h、明暗顛倒、潮濕墊料10 h、空瓶放置1 h。連續18 d。從第19天開始，連續72 h快速動眼相睡眠剝奪，采用小平臺水環境法[5]。剝奪箱為30×30×40 cm的玻璃水箱，正中立一個直徑6 cm圓形平臺，箱中注滿水，水面距平臺面約1 cm。大鼠在平臺上可自由進食進水；如果睡眠，會因為肌張力松弛而落入水中。造模期間持續燈光照射，室內溫度控制在18.0℃～22.0℃，水溫保持在20℃左右。

1.4 干預方法 正常組：常規飼養，不接受任何刺激與處置。模型組：不予任何治療。針刺組：根據《實驗針灸學》[6]大鼠穴位定位方法取百會、神庭和內關。穴位常規消毒，采用蘇州醫療用品廠生產的華佗牌0.25×25 mm針灸針進行針刺。百會、神庭向尾部斜刺，進針深度約為2 mm，內關直刺1 mm，每穴均勻捻轉刺激30 s，留針15 min。每天在安排應激前1 h開始進行針刺，每日1次，連續21 d。

1.5 行為學測定 使用Open-Field法評分，以大鼠在3 min內的水平運動得分和垂直運動得分之和為大鼠總的自主活動量，于分組前和造模21 d后進行。

1.6 海馬5-HT1AR、5-HT2AR mRNA檢測 造模21 d，于進行行為學評分后處死大鼠，取大鼠海馬置液氮中待檢。5-HT1AR、5-HT2AR引物序列、擴增長度及PCR反應條件見表1，以β-actin為內參。Trizol試劑一步法抽提總RNA后，取RNA產物1.0 μg，用M-MLV逆轉錄酶合成cDNA，然后用PCR擴增儀進行PCR反應。用2%瓊脂糖電泳，電泳結束后置凝膠成像系統中進行分析，計算與內參β-actin的比值用以校正。

表1 5-HT1AR、5-HT2AR、β-actin引物序列、擴增長度

1.7 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件，所有數據用±s)表示，符合正態分布資料采用單因素方差分析，非正態分布資料采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 自主活動 應激前各組大鼠的自主活動無顯著性差異(P＞0.05)。接受應激21 d后，模型組自主活動較正常組明顯減少(P＜0.01)。與模型組比較，針刺組在治療后大鼠自主活動明顯增加(P＜0.01)。見表2。

2.2 海馬5-HT1AR、5-HT2AR mRNA表達 與正常組比較，模型組大鼠海馬5-HT1AR mRNA表達水平明顯下降、5-HT2AR mRNA表達水平明顯上升(均P＜0.01)；與模型組比較，針刺組大鼠海馬5-HT1AR mRNA表達水平上調，5-HT2AR mRNA表達水平下降(均P＜0.05)。見表3。

3 討論

睡眠具有維持個體生存、促進生長發育、調整和恢復體力、促進學習、形成記憶的功能。睡眠剝奪可引起情緒、學習記憶、免疫功能等一系列變化[7]，對人們的身心健康、日常生活與工作有很大影響。睡眠障礙不但是抑郁癥的癥狀之一，同時也是導致抑郁癥的主要因素之一；睡眠障礙的改善對抑郁癥的緩解與康復有促進作用。抑郁癥睡眠障礙的發病機制至今未徹底闡明。一般認為，抑郁癥除了與心理、社會因素和遺傳因素有關外，主要還與中樞去甲腎上腺素(NE)、5-HT等單胺類神經遞質減少、受體敏感性改變以及遞質間失衡等因素有關。有研究提示，抑郁癥的睡眠障礙與抑郁癥發病機制有關[8]。作為腦邊緣系統重要組成部分的海馬與抑郁癥關系十分密切[9]。海馬區域5-HT含量或功能異常可能與精神疾病、睡眠障礙等多種疾病有關。

表2 各組大鼠自主活動量的變化

表3 各組大鼠海馬5-HT1AR、5-HT2AR mRNA的表達

分子生物學與藥理學的研究結果顯示，目前人類5-HTR至少存在7種亞型，其中5-HTlR和5-HT2R家族與抑郁癥關系密切。5-HTR中含量最豐富的是5-HT1AR，按其分布位置可以分為突觸前膜受體和突觸后膜受體兩類，兩者共同作用調節5-HT的釋放[10]。突觸后膜受體廣泛分布于5-HT能神經傳入的前腦區，尤其是皮質、海馬、中隔、杏仁體及下丘腦，定位于神經元的軸突上，被激活后引起突觸后膜超極化，抑制神經元的興奮性[11]。研究表明，5-HT2AR及5-HTlAR的表達與睡眠障礙相關[12]，拮抗5-HT2AR上調具有明確改善睡眠障礙的效應。

針刺是我國傳統中醫療法，在治療抑郁方面與藥物比較具有起效快、整體調節、多靶點作用、安全性高、無副作用等優點。實驗研究證實，針刺治療可以改善抑郁癥模型大鼠的行為學異常，起效快，且能夠通過改善前額皮質區單胺類神經遞質含量而發揮抗抑郁作用[13]。

古代文獻中有很多關于將百會、神庭、內關穴用于調神和治療情志病的記載。百會、神庭為督脈經穴，督脈上行入腦，且百會位居巔頂，為百脈聚會之處，可清利頭目、疏通腦絡，健腦寧神，此2穴合用，具有調節腦神、安神鎮靜的作用。內關為手厥陰心包經之絡穴，通陰維脈，別走手少陽三焦經，三焦主氣，有寬胸理氣、疏通氣血、養心安神之效。

本研究綜合孤養與不可預見的慢性應激刺激誘導建立抑郁大鼠模型，同時應用小平臺水環境法對抑郁模型大鼠進行72 h的連續快速動眼相睡眠剝奪。結果顯示，針刺對SDD大鼠具有良性的整體調節作用，可能通過上調海馬5-HT1AR、下調5-HT2AR表達來調整5-HT受體間不平衡，從而發揮治療效應。

由于針刺治療具有整體調節、多靶點作用等特點，關于針刺治療SDD的確切機制還有待于今后進行更深入的研究。

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