白藜蘆醇誘導人皮膚鱗狀細胞癌凋亡的蛋白質組學研究

羅佩誼 陳謹萍 李海翩

(廣州市婦女兒童醫療中心 廣州 510623)

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物,具有抗炎、抗氧化、保護心血管等作用,一直用于心血管病防治中。最近發現其具有抗癌作用,可以降低小鼠皮膚癌的發生[1],對胃癌、肺癌、白血病、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤也有抑制作用[2]。發現其能夠下調Survivin的表達、激活Caspase3活性、介導Fas/FasL信號通路誘導腫瘤細胞凋亡[3],但具體的分子機制目前還不明確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與培養 人皮膚鱗狀細胞癌細胞株SCL-1培養在含10%小牛血清RPMI 1640培養基中。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞活性 不同濃度的白藜蘆醇(0,25,50,100μM)處理細胞SCL-148h。然后加5mg/mL的MTT標記細胞,用酶標儀(波長570nm)測定各孔的A值。存活率%=(白藜蘆醇處理A/空白對照組A)×100%。

1.2.2 流式細胞檢測細胞凋亡 按Annexin V和PI雙染色試劑盒進行,SCL-1細胞用50μM白藜蘆醇處理48h,對照組用DMSO處理48h。用Annexin V和PI染色細胞,流式細胞儀定量分析細胞凋亡狀況。

1.2.3 SILAC定量蛋白質組學標記 分別用12C6-Lysine和13C6-Lysine分別標記SCL-1細胞后,用50μg/mL的白藜蘆醇處理13C6-Lysine標記的細胞48h,以DMSO處理12C6-Lysine標記的細胞為對照。收集細胞,用細胞裂解液裂解,收集上清液,BCA法測定蛋白質濃度。

圖1 MTT實驗證實白藜蘆醇降低人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞的存活率

1.2.4 溶液酶解 將上述2種蛋白質1∶1等量混合,按照膠內酶解法,用Trypsin蛋白酶進行酶解過夜,冷凍干燥獲得酶解肽段。

1.2.5 SCX-LC-MS/MS質譜鑒定 將獲得蛋白質酶解肽段用SCX-LC-MS/MS進行液質聯用質譜鑒定,獲得的譜峰用MAXQ uant軟件進行蛋白質鑒定和定量分析,獲得差異蛋白質分子。

2 結果

2.1 白藜蘆醇抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞的活性

從圖1可以發現隨著濃度的升高,白藜蘆醇對SCL-1細胞生長抑制作用越明顯,細胞存活率與白藜蘆醇濃度呈負相關,細胞的存活率從100%降為56.7%(50μg/mL)和38.1%(100μg/mL)。

2.2 白藜蘆醇介導細胞凋亡

流式細胞術分析結果顯示,當白藜蘆醇濃度為50μg/mL時,凋亡細胞的數目總細胞總數目的37.3%,而DMSO對照組凋亡細胞只占2.80%,說明白藜蘆醇介導了SCL-1細胞的凋亡(圖2)。

2.3 白藜蘆醇調控的差異蛋白質分子

總共鑒定了11個受白藜蘆醇調控的差異蛋白質分子,包括上調的PPAN,PDCD11,TRIM10,HIF1A,BCLAF1,HSPA9,表達下調的MAFF,RAP2A,BAG1,HNRPLL,14-3-3。

3 討論

圖2 流式細胞術分析確定白藜蘆醇能夠誘導細胞凋亡

最早在1997年發現白藜蘆醇能夠降低小鼠皮膚癌的發生率。當前研究進一步發現白藜蘆醇也可以抑制胃癌、結腸癌、肺癌等多種腫瘤的生長、誘導腫瘤細胞凋亡。本研究中,我們從細胞水平證實白藜蘆醇能夠抑制人皮膚鱗狀細胞癌的活性,導致其發生凋亡。

我們第一次采用蛋白質組學策略,鑒定獲得了11個新的受白藜蘆醇調控的差異蛋白質分子,包括BAG1,PDCD11,BCLAF1,HSPA9,YWHAZ等5個已經證實與細胞凋亡密切相關的蛋白質分子,這與我們觀察到的白藜蘆醇介導皮膚癌細胞凋亡的生物學效應是一致的。

BCLAF1是一個調控Bcl-2基因轉錄的轉錄抑制因子,它的過表達能夠誘導細胞凋亡。在本研究中我們發現白藜蘆醇能夠顯著上調BCLAF1蛋白的表達水平,上調的BCLAF1從而轉錄抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達,從而導致皮膚鱗狀細胞癌細胞凋亡。

BAG1是一個抗凋亡蛋白質分子,能夠與Bcl-2家族蛋白結合調控細胞凋亡生物學過程。本研究發現白藜蘆醇下調抗凋亡蛋白BAG1的表達水平,從而有助于細胞凋亡的發生。同時也發現另一個細胞凋亡調控蛋白PDCD11的表達水平在白藜蘆醇作用下上調。PDCD11是一個轉錄因子NFκB結合蛋白,研究發現PDCD11能夠調控FasL的轉錄,從而介導細胞凋亡。在前期研究中發現白藜蘆醇可以調控Fas/FasL凋亡通路介導介導細胞凋亡[4]。在本研究中,我們進一步發現白藜蘆醇通過上調PDCD11的表達而激活Fas/FasL凋亡通路,從而闡明了白藜蘆醇激活Fas/FasL凋亡通路的原因。

14－3－3zeta/delta是一個抗凋亡因子,在多個通路和環節與一些蛋白質分子相互作用,抑制凋亡的發生。其能夠與一些凋亡相關蛋白,如Bad,Bax結合,抑制這些凋亡相關蛋白的亞細胞定位,參與細胞凋亡的調控。目前研究發現香膠甾酮介導頭頸部腫瘤的凋亡,主要是抑制14－3－3zeta蛋白的表達而發生作用,建議其可能是香膠甾酮的一個藥物靶標[5]。我們發現白藜蘆醇也能夠下調14－3－3zeta/delta蛋白的表達,意味著14－3－3zeta/delta也可能是白藜蘆醇介導細胞凋亡的一個靶標分子。

11個新的受白藜蘆醇調控的差異蛋白質分子的鑒定,為我們深入理解白藜蘆醇抗腫瘤的分子機理提供了依據和線索,有助于我們深入白藜蘆醇的作用機制。

[1]Marier JF,Chen K,Prince P,et al.Can J Vet Res[J].2005,69(2):151～154.

[2]Bhat KP,Pezzuto JM.Ann N Y Acad Sci[J].2002,957:210～229.

[3]Kartal M,Saydam G,Sahin F,et al.Genes Nutr[J].2011,6(2):171～179.

[4]Lacana E,D'Adamio L.Nat Med[J].1999,5(5):542～547.

[5]Macha MA,Matta A,Chauhan S,et al.BMC Cancer[J].2010,10:655.