GSTθ轉(zhuǎn)染對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲性的影響

喬惠萍 李啟民 陳鵬

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放療科 內(nèi)蒙古包頭 014010)

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是超基因家族酶,為細(xì)胞解毒系統(tǒng)的重要成分,可能保護(hù)細(xì)胞免受活性氧代謝產(chǎn)物損傷的物質(zhì)[1～3]。人類GSTθ存在著基因的多態(tài)性,如20%的高加索人和80%的亞洲人缺少這種酶。正因為GSTθ的多態(tài)性,有可能影響到人類發(fā)生暴露相關(guān)腫瘤的危險性。GSTθ空白基因型在宮頸癌病人非常常見,在年輕宮頸癌病人的發(fā)生較60歲以上病人中更常見。而且,GSTθ空白基因型與低分化腫瘤的相關(guān)性更強,這表明攜帶這種基因的個體對宮頸癌有較高的遺傳易感性[5]。

在本研究中通過將GSTθ基因,穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到了人類宮頸癌HeLa細(xì)胞,并觀察了轉(zhuǎn)染后GSTθ高水平表達(dá)對細(xì)胞生長及細(xì)胞侵襲能力的影響,以了解GSTθ基因改變可能對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用,從而為GSTθ基因作為腫瘤抑制基因為腫瘤基因治療提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自美國ATCC菌種保藏中心,新生小牛血清(美國Gibco),DMEM凍干粉(美國Gibco),MTT(普飛生物科技公司),DMSO(國藥集團(tuán)),酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司),CKX41倒置顯微鏡、C-7070數(shù)碼相機(OLYMPUS),pcDNA3(美國Invitrogen公司),Lipofectamine(美國Invitrogen公司),Trizol(加拿大Bio Basic公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Bio Basic公司),PCR擴增試劑劑盒(上海生工)。

圖1 HeLa細(xì)胞在GSTθ表達(dá)。收集呈指數(shù)生長的細(xì)胞并按“材料和方法”中所描述在采用RT-PCR法測定GSTθ mRNA的表達(dá)水平。圖所示為三次重復(fù)實驗中一典型的實驗結(jié)果。圖中,M,DNA marker;1和3為未HeLa母細(xì)胞;2和4為HeLa-GSTθ細(xì)胞。GADPH mRNA同時測定作為樣本間的對照。

1.2 方法

1.2.1 GSTθ細(xì)胞轉(zhuǎn)染和GSTθ高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞的建立 一全長人類GSTθ cDNA定向地克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3中,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法根據(jù)其提供的使用說明書將構(gòu)建好的pcDNA3/GSTθ載體導(dǎo)入HeLa細(xì)胞中,并在含有500μg/mL G418的培養(yǎng)液進(jìn)一步篩選培養(yǎng)。大約2～3周后,可見典型的抗G418的克隆形成。克隆細(xì)胞再進(jìn)一步培養(yǎng)和擴展,最后采用RTPCR檢測克隆細(xì)胞中GSTθ基因mRNA表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染了pcDNA3-GSTθ的HeLa細(xì)胞則命名為HeLa-GSTθ。

1.2.2 RT-PCR辦法 收集取對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染的HeLa母細(xì)胞和HeLa-GSTθ細(xì)胞,采用Trizol按Trizol試劑盒的說明書提取總RNA,紫外分光光度計分別測定RNA純度(A260/A280>1.90)。用DEPC水調(diào)整RNA濃度為5μg/μL。各取總RNA1μL,加入1μLOligo(dT),10μLDEPC水,輕混70℃水浴5min,并在冰浴冷卻30s。然后在冰上加入4μL5x反應(yīng)液,1μLRNase抑制劑(20U/μL),2μLdNTP混合液(10mmol/L),在37℃水浴加熱5min,加入1μLM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(20μ/μL),在37℃逆轉(zhuǎn)錄為1h,最后在70℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶10min,置-20oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 GSTθ高水平表達(dá)對細(xì)胞生長的影響。 采用“材料和方法”中所描述的細(xì)胞計數(shù)法測定細(xì)胞的生長。

圖3 劃痕實驗0hHeLa母細(xì)胞圖象

圖4 劃痕實驗0hHeLa-GSTθ細(xì)胞圖象

圖5 劃痕實驗72hHeLa母細(xì)胞圖象

圖6 劃痕實驗72hHeLa-GSTθ細(xì)胞圖象

根據(jù)Genebank中GSTθ(GSTT1, NP_000844)的基因序列,采用引物設(shè)計軟件primer premier 5進(jìn)行引物的設(shè)計。引物序列分別為:GSTθ上游引物5’-CCC GGA TCC CGC ATG GGT CTG GAG CTC TAC CTG GAC-3’,下游引物為5’-GGG GAA TTC CCG GAT CAT GGC CAG CAC CCA GGG-3’,擴增產(chǎn)物為723bp。GADPH上游引物為5’-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3’,下游引物為5’-CAA CCT GGT CAG TGT AG-3’,擴增產(chǎn)物為724bp。反應(yīng)條件為:48℃逆轉(zhuǎn)錄45min;94℃滅活及預(yù)變性2min;再經(jīng)58℃45s,72℃45s,反應(yīng)32個循環(huán),68℃延伸7min。最后,PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.2.4 細(xì)胞記數(shù) 采用0.25%胰酶消化收集對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞和HeLa-GSTθ細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)后制成2×104/mL細(xì)胞懸液,并接種于六孔培養(yǎng)板。細(xì)胞然后連續(xù)培養(yǎng)8d,每組設(shè)3個復(fù)孔,每天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),最終繪制生長曲線。

1.2.5 劃痕拍照方法 分別取對數(shù)生長期的HeLa母細(xì)胞和HeLa-GSTθ細(xì)胞,以106/mL的濃度接種于35mm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)至細(xì)胞完全飽和。用無菌200μL的槍頭在每皿細(xì)胞中劃出一條等寬直線細(xì)痕,制作細(xì)胞傷口模型;無菌PBS清洗3次以除去漂浮細(xì)胞。此時設(shè)為劃痕后零時,拍照。繼續(xù)培養(yǎng),每隔24h在顯微鏡下觀察劃痕寬度,采并用數(shù)碼相機拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 GSTθ高表達(dá)HeLa穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的建立

如圖1所示,HeLa母細(xì)胞含有低的GSTθmRNA表達(dá)水平, 而轉(zhuǎn)染了pcDNA3-GSTθ載體的HeLa-GSTθ穩(wěn)定細(xì)胞中GSTθ mRNA的表達(dá)則明顯提高。這一結(jié)果表明GSTθ重組質(zhì)粒的構(gòu)建是成功,并能成功在HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和表達(dá)GSTθ基因。

2.2 GSTθ高表達(dá)降低HeLa細(xì)胞的生長

我們比較了HeLa母細(xì)胞和HeLa-GSTθ細(xì)胞的生長。HeLa/GSTθ細(xì)胞的生長率明顯比HeLa母細(xì)胞慢。細(xì)胞的倍增時間分別為:HeLa母細(xì)胞為18h,而HeLa/GSTθ細(xì)胞則為24h。這說明轉(zhuǎn)染了GSTθ可以延遲HeLa細(xì)胞的生長。兩條細(xì)胞生長曲線逐漸分開。

2.3 GSTθ高表達(dá)降低HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力

我們應(yīng)用劃痕拍照方法記錄了HeLa母細(xì)胞和HeLa GSTθ細(xì)胞劃痕后向空白區(qū)域的侵襲生長能力。72h后,HeLa母細(xì)胞已經(jīng)完全將劃痕區(qū)域長滿,而HeLa GSTθ細(xì)胞劃痕區(qū)仍有很大空隙,HeLa GSTθ細(xì)胞向其他地方侵襲轉(zhuǎn)移的能力明顯比HeLa母細(xì)胞低。

3 討論

在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)通過GSTθ真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GSTθ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以明顯地增加宮頸癌HeLa細(xì)胞中的GSTθ表達(dá)水平,而GSTθ表達(dá)水平的增加導(dǎo)致了HeLa細(xì)胞的生長率降低,HeLa-GSTθ細(xì)胞的倍增時間從18h增加到了24h。這些結(jié)果說明GSTθ基因可能是宮頸癌的抑制基因。

腫瘤細(xì)胞的生長一般都有向周圍組織侵襲的特性,宮頸癌細(xì)胞也具有這一特性,臨床上常常發(fā)現(xiàn)局部晚期的患者,由于腫瘤的侵犯而導(dǎo)致患者失去治療的機會。在本實驗中,我們通過實驗證明了轉(zhuǎn)染了GSTθ基因的HeLa-GSTθ細(xì)胞侵襲能力明顯下降。這一結(jié)果說明GSTθ基因有可能降低宮頸癌的惡性程度。

我們所得出的實驗,結(jié)果盡管機制還不清楚,但這些體外研究為將來GSTθ腫瘤的基因治療提供了實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。關(guān)于GSTθ基因通過怎樣的渠道影響了細(xì)胞增殖周期,其作用的關(guān)鍵點是什么,以及GSTθ基因是怎樣影響了宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲能力是我們正在努力工作研究的方向。

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