高同型半胱氨酸血癥誘導eNOS脫偶聯損害冠狀動脈內皮功能

王 瑩，何立蕓，毛節明，王 廣*

(1北京市海淀醫院，北京100080;2北京大學第三醫院)

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是冠狀動脈疾病(CAD)的獨立危險因素［1］，其可以通過損害血管內皮細胞、促進炎癥、氧化應激等機制導致血管內皮功能紊亂［2］。近年研究發現，Hcy可以通過降低血管內皮細胞四氫生物蝶呤(BH4)的生物利用度而引起內皮型一氧化氮合酶(eNOS)脫偶聯，導致氧化應激及一氧化氮(NO)產生減少［3］。Coppola 等［4］給予 2型糖尿病患者蛋氨酸負荷造成急性HHcy后發現，患者冠狀動脈內皮功能顯著降低。然而，慢性HHcy是否對患者冠狀動脈內皮功能有影響以及可能的機制尚不十分清楚。在本研究中，我們探討慢性HHcy是否通過降低BH4的水平，引起eNOS的脫偶聯，導致冠狀動脈內皮功能的紊亂。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年9月～2009年5月，本研究采用病例對照的設計，入選病例均檢測空腹Hcy濃度，以高于15 μmol/L為標準分為兩組:健康對照組50例，其中男33例、女 17例，年齡(55.12±12.71)歲;HHcy組21例，其中男15例、女6例，年齡(52.90±13.23)歲。兩組患者均排除急性心肌梗死、冠狀動脈疾病(冠狀動脈造影顯示＞50%狹窄)、心力衰竭、肝腎功能異常、癌癥、感染性疾病、服用硝酸鹽類及B族維生素類藥物影響指標測定等。

1.2 方法

1.2.1 血漿 BH4水平測定 取400 μl血漿置于EP 管中，加入100 μl 1 mol/L 三氯乙酸(TCA)，4 ℃20 000 g離心15min后，各取170 μl上清液轉移到2個新的EP管中，分別進行酸、堿氧化。酸氧化過程:每 170 μl上清液中加入 25 μl酸性碘液(0.5%iodine、1%KI溶于 0.2 mol/L TCA 中)混勻后，室溫避光靜置60min，而后加入10 μl 1%新鮮配制的抗壞血酸，4 ℃ 20 000 g離心10min，取上清170 μl用于測定總的蝶呤水平(BH4+BH2+生物蝶呤);堿氧化過程:每 170 μl上清液中加入 10 μl 6 mol/L NaOH 和 25 μl堿性碘液(0.5%iodine、1%KI溶于0.2 mol/L NaOH中)，室溫避光靜置60min，而后加入10 μl 6 mol/L HCl及 10 μl 1%新鮮配制的抗壞血酸，4℃ 20 000 g離心10min，取上清170 μl用于測定BH2和生物蝶呤的水平。經酸堿氧化處理后，即刻利用高效液相色譜儀器進行測定，條件為:流動相:甲醇/水 =5/95;流速:1.0 ml/min;柱溫:25 ℃;激發和發射波長分別為350、440 nm，生物蝶呤出峰時間大約為8min，各實驗組的測定含量通過標準曲線獲得，BH4的含量由酸堿氧化差值得出。

1.2.2 冠狀動脈內皮功能檢測 冠脈血流速度儲備(CFVR)在一定程度上反映冠狀動脈內皮功能，由經胸超聲心動圖血流顯像技術檢測。在冠脈血流顯像模式下記錄靜息狀態及最大充血狀態下［應用腺苷0.14 mg/(kg·min)］左前降支血流速度峰值，計算充血狀態及靜息狀態血流速度峰值比值，即為CFVR。

1.2.3 血漿NO水平的檢測 采用硝酸還原酶法測定患者血漿NO含量，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.2.4 血漿生化指標檢測 患者血漿總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、血糖、Hcy水平等指標，由醫院檢驗科測定。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，實驗數據以±s表示，計數資料采用兩組頻數的χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 Hcy、BH4、NO 及 CFVR 表達 見表1。

表1 兩組研究對象血漿Hcy、BH4、NO及 CFVR 水平(±s)

表1 兩組研究對象血漿Hcy、BH4、NO及 CFVR 水平(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

CFVR對照組組別 Hcy(μmol/L)BH4(pmol/ml)NO(μmol/L)11.3 ±2.2 1.73 ±0.52 119.5 ±36.7 3.09 ±0.50 HHcy組 23.2 ±10.1* 1.43 ±0.41* 99.6 ±32.2* 2.76 ±0.50*

2.2 相關性分析 所有患者中，以血漿NO為應變量，以Hcy為自變量，結果顯示血漿NO濃度與Hcy呈負相關性(r= －0.28，P ＜0.05);以 CFVR 為應變量，以Hcy為自變量，結果顯示CFVR與Hcy呈顯著負相關性(r= －0.34，P ＜0.05)。

3 討論

HHcy是心血管疾病的獨立危險因素。本研究中我們發現，慢性HHcy患者冠狀動脈內皮功能明顯受損，同時伴有血漿BH4和NO水平的降低;患者血漿BH4和NO水平呈顯著正相關性;此外，血漿Hcy水平與NO、CFVR分別呈顯著負相關性。從而提示慢性HHcy可能通過降低BH4生物利用度引起eNOS的脫偶聯，導致NO產生減少及冠狀動脈內皮功能紊亂。

血管內皮細胞產生的NO對維持血管穩態起著至關重要的作用，如維持血管張力、抑制血小板的聚集、白細胞的遷移以及黏附、抑制炎癥反應和平滑肌細胞的增殖等。因而，NO的生物學活性降低是內皮功能不全的標志性事件［5］。NO是由eNOS催化底物精氨酸轉為瓜氨酸而產生，此過程需要輔助因子BH4的參與。當BH4減少或缺乏時，eNOS產生的NO減少，而ROS產生增加，此過程稱之為eNOS的脫偶聯。我們的研究也發現患者血漿NO和BH4水平是呈正相關性的，從而提示BH4在NO產生途徑中起著重要作用。

一系列的研究表明，HHcy可以通過增加氧化應激、降低NO生物利用度引起血管內皮功能的紊亂。Hcy可以通過降低血管內皮細胞BH4的生物利用度而引起eNOS脫偶聯，導致氧化應激及NO產生減少［3］。Hcy降低內皮依賴的血管舒張功能并能增加內皮細胞超氧陰離子的產生，而給予BH4預處理后，內皮依賴的血管舒張功能得到改善的同時伴有內皮細胞超氧陰離子產生減少［6］。我們前期研究發現，Hcy可能通過活化NADPH氧化酶途徑，誘導ROS產生及分泌趨化因子，從而加速動脈粥樣硬化的進程［7，8］。我們臨床試驗也發現急性冠脈綜合癥患者血漿Hcy及MCP-1的水平顯著升高［9］。在本研究中我們發現慢性HHcy患者血漿BH4和NO水平是顯著降低的，同時伴有CFVR水平的降低，后者在一定程度上能反映患者冠狀動脈內皮功能［10］。Coppola等［4］給予 2 型糖尿病患者蛋氨酸負荷造成急性HHcy后發現，患者CFVR水平也是顯著降低的，這與我們的結果相一致。此外，我們的研究還發現血漿Hcy水平與NO、CFVR分別呈負相關性，提示慢性HHcy是引起冠狀動脈內皮功能損傷的危險因素。

綜上所述，慢性HHcy可能通過降低BH4的生物利用度引起eNOS脫偶聯，導致NO產生減少及冠狀動脈內皮功能紊亂，最終導致冠狀動脈疾病的發生。

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