ITS2序列鑒定小茴香及其常見混偽品

劉義梅 羅焜 陳科力 陳士林

小茴香為臨床常用中藥，傳統中醫藥理論認為其具有散寒止痛、理氣和胃的功效[1]。本品來源于傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果實，有些地區把同科植物蒔蘿AnethumgraveolensL.、毒芹CicutavirosaL.、孜然芹CuminumcyminumL.、防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk、葛縷子CarumcarviLinn.的果實作為小茴香藥用[2-5]。這5種混偽品與正品小茴香同樣來源于傘形科植物的果實，在形態上同為雙懸果，都具有特異香氣且顯微特征同樣具有油室或者油管等，傳統的經典鑒定方法難以準確鑒定。隨著分子生物學的發展，DNA條形碼技術以其不受被檢測對象的形態特征以及發育階段影響等優點而為中藥鑒定領域所關注，其熱點候選序列—ITS2已被證明在藥用植物鑒定方面具有潛在的研究價值[6-11]，本研究運用ITS2序列鑒定小茴香及其常見混偽品，為小茴香藥材的快速和準確鑒定提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗采集小茴香4個樣本，材料經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定，憑證標本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所，見表1。其余42個樣本6個物種來源于GenBank，見表2。

1.2 DNA提取和PCR擴增、PCR產物純化及序列測定

樣品的DNA提取、PCR擴增及測序的方法均參照文獻[7]。

1.3 數據分析

測序獲得的峰圖利用CondonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.,USA)校對拼接。實驗數據與GenBank上下載的ITS2序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和26S，獲得ITS2間隔區序列。通過MEGA4.1軟件對小茴香不同樣本進行種內序列對比，計算小茴香的種內最大K-2-P距離和種間最小K-2-P距離，并構建其NJ系統發育樹。利用Schultz等人[12]的研究方法預測各物種ITS2莖環二級結構。

2 結果與分析

2.1 測序峰圖

實驗序列JF421497的峰圖(見圖1)，其序列長度為222 bp，其中221個堿基的Q值均大于等于20，具有1個POLY(C)和1個POLY(T)結構，GC含量為55.1%。

圖1 實驗序列JF421497的峰圖

2.2 小茴香不同樣本種內序列比對

通過比對17個小茴香樣本的ITS2序列，結果顯示JF421497、HQ377209、HQ377210、HQ377211、HQ377212、HQ377213、HQ377215、GQ434700、GQ434701、GQ148792、GQ148793、AY581806、FJ980396這11條序列完全相同，HQ377206和HQ377208完全相同，17個樣本有4種不同的序列，這4個不同序列的長度為219～222 bp，具有1個POLY(C)和1個POLY(T)結構，GC含量為54.3%-54.9%，平均GC含量為54.8%，共有10個堿基變異，平均K-2P距離為0.0044，種內最大K-2P距離為0.0307。見圖2。

表1 實驗材料采集地及GenBank登錄號

表2 GenBank下載樣本物種信息

圖2 不同樣本小茴香的種內序列比對

2.3 小茴香與易混偽品的種間序列比對

從圖3中可以看出，小茴香及其5種混偽品的種間序列共有89個位點變異，信息位點有37個。小茴香及其同屬易混偽品的種間平均K-2-P距離為0.2479，最小K-2-P距離為0.0405。

2.4 ITS2序列二級結構

如圖4所示，小茴香與其5個混偽品在二級結構上有明顯差異。重點差異存在于螺旋I和螺旋III中。小茴香二級結構螺旋I存在7個小莖環和1個大莖環，蒔蘿為4小莖環和1個大莖環，葛縷子為4個小莖環和2個大莖環，孜然芹為4個小莖環，毒芹和防風為6小莖環和1個大莖環。茴香二級結構螺旋III的莖環在數量、大小及位置與其他物種也存在明顯不同，正偽品ITS2二級結構螺旋(Helix)區之間的反轉角度也各不相同。因此，ITS2二級結構也可作為鑒定小茴香及其混偽品的一個方法。

圖3 小茴香與易混偽品的種間比對

圖4 小茴香及其五種混偽品的ITS2二級結構

2.5 小茴香及其混偽品的ITS2序列NJ樹鑒定

圖5 基于ITS2序列構建的小茴香及其混偽品的鄰接(NJ)樹(bootstrap1000次重復，枝上數值僅顯示自展支持率≥50%，采用k-2p距離法)

從基于ITS2構建的NJ樹圖可以看出，小茴香具有單系性，不同個體聚在一起，同時也很容易與其混偽品區別開來。因此ITS2序列適用于藥材小茴香與其混偽品的鑒定。

3 討論

本實驗通過對小茴香核基因序列進行研究，顯示ITS2序列在小茴香基源植物鑒定方面具有以下特點：小茴香ITS2序列較短，約為220 bp，降低了提取、擴增和測序的難度，此特性也將更有利于獲取發生降解的樣本序列，對于DNA條形碼技術在中藥材應用具有重要的意義；通過對小茴香及其混偽品數據的分析，發現17樣本ITS2序列種內最大K-2-P距離小于種間最小距離。同時，從基于ITS2序列構建的小茴香及其易混品NJ樹可以看出，小茴香17個樣品聚為一支，支持率為97，明顯與其常見混偽品分開。說明通過ITS2序列能很好的區分小茴香及其混偽品；小茴香及其混偽品的ITS2二級結構，都存在4個螺旋區域，各螺旋上的莖環，以及彼此間的夾角存在明顯的不同，也說明ITS2二級結構有助于鑒定小茴香及其混偽品。

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