芳香新塔花黃酮抗氧化活性及對大鼠乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用

廖晶晶 徐建國 楊偉俊 劉沖 地力努爾 滿爾哈巴

唇形科新塔花屬ZiziphoraL.在中國分布4種，均產新疆，其中芳香新塔花(Z.clinopodioidesLam.)資源最為豐富，生長于南北疆各山區的山地草地、礫石質坡地及半荒漠草灘上。由于其獨特的芳香氣味，也是一種牛羊等牲畜喜食的牧草。芳香新塔花藥用地上部分，系維吾爾醫和哈薩克醫習用藥材，性“二級干寒”。芳香新塔花具有強心利濕，理氣化痰，消炎散結之功能，用于心臟病，氣短多汗，水腫，氣管炎等疾患[1]；也可用于感冒發熱，高血壓，心悸失眠等癥[2]。中醫臨床上也用于治療高血壓以及心肌缺血[3，4]。芳香新塔花具強烈的芳香氣味，地上部分含揮發油、萜類、生物堿、黃酮類等[5-9]。課題組從事芳香新塔花藥材繁育、規范化種植、化學研究及新藥開發等方面的研究工作多年，首次起草并制定了芳香新塔花藥材的質量標準[10]。通過對中國新塔花屬進行系統研究后發現，芳香新塔花具有顯著的藥理活性[11]，采用藥效活性追蹤的研究方法，從具有活性的部位中分離得到了一系列黃酮類化合物[9]，并采用溶劑提取、大孔吸附樹脂分離純化得到芳香新塔花總黃酮有效部位(Z. clinopodioides flavonoids，ZCF)。本實驗通過研究ZCF體外抗氧化活性以及對缺氧—復氧損傷和氧化損傷的心肌細胞的影響，為進一步探索藥效物質基礎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠乳鼠(出生1～3天)，雌雄不限，均由新疆醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：新醫動字SYXK(新)2003-0001。

1.2 藥物

芳香新塔花黃酮(ZCF)，新疆維吾爾自治區藥物研究所維吾爾藥研究室制備，純度71.0%，黃色粉末。

1.3 試劑

二苯代苦味酰自由基 (2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl，DPPH·)，購自美國Sigma公司。MTT，Amresco公司，批號：080717。胰酶，Amresco0458，批號：081011。鏈霉素，華北制藥股份有限公司產品，批號081112。DMEM培養粉(高糖、低糖)，Invitrogen Corporation產品，批號：081004。注射用氨芐西林鈉，中諾藥業有限公司生產，批號：081120。其它所用試劑均為分析純。丙二醛(MDA)測試盒，批號：090103，100T，南京建成生物工程研究所生產。

1.4 儀器

DG-5031型酶聯免疫檢測儀，華東電子集團醫療裝備有限責任公司產品；Shimadzu UV-2501 紫外可見分光光度計(日本島津制造所)；BS124S電子天平(塞多利斯)；。

1.5 ZCF清除 DPPH·實驗

精確吸取ZCF貯備液，用乙醇稀釋為0.01 mg/ml、0.0125 mg/ml、0.0167 mg/ml、0.025 mg/ml、0.05 mg/ml的系列溶液，取各濃度溶液2 ml，加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·，搖勻，反應30 分鐘 后，在紫外可見分光光度計上，517 nm波長處測定吸收值，記錄吸光度值為A樣品。用2 ml無水乙醇加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·溶液為空白對照，搖勻，反應30 分鐘測得的吸光度為A空白對照，計算公式為：DPPH·清除率(%)=[1-A樣品/A空白對照]×100%。

同上法，測定不同濃度維生素C(VC)溶液的A樣品VC，A空白對照VC。

1.6 ZCF對培養乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用[12]

1.6.1 乳鼠心肌細胞原代培養 出生1～3天SD大鼠乳鼠，無菌取出心臟，冷PBS溶液清洗后剪碎成約1～3 mm3的小塊，0.25%胰酶分次消化，再離心分離細胞，用DMEM(含10%胎牛血清)懸浮轉移并接種于培養瓶中，差速貼壁純化法，除去成纖維細胞。初步純化后的乳鼠心肌細胞懸液(1×105/ml)分別接種并培養3～4天，用于實驗。

1.6.2 細胞存活率實驗 心肌細胞與不同濃度的藥物共育24 小時后，棄去培養液，每孔加無血清的DMEM 180 μl和MTT 20 μl，培養4 小時，除去上清，每孔加DMSO 150 μl，混合均勻后，10 分鐘內在570 nm處測吸光度(A)值。

1.6.3 缺氧—復氧模型的建立 心肌細胞培養72 小時后，用缺氧液(預先用高濃度氮氣飽和的培養液)置換正常培養液，放入缺氧培養箱(氮氣99.99%)，缺氧120分鐘，再用模擬再灌注液置換復氧液(預先用純氧飽和培養液)于5% CO2、37℃溫箱中復氧60分鐘，用硫代巴比妥酸顯色法測MDA的量。

1.6.4 試藥對乳鼠心肌細胞缺氧—復氧的影響 由細胞存活率實驗確定ZCF實驗劑量，并將實驗分為6組：正常細胞培養組(培養板置培養箱中持續孵育3 小時結束實驗)；缺氧—復氧損傷模型組(缺氧2 小時，復氧1小時)；缺氧—復氧損傷+ZCF各劑量組(缺氧2 小時，復氧1 小時，缺氧—復氧時均給藥)。以不加試藥的細胞培養液孔的吸光度均值與加試藥各孔的吸光度均值之比作為抑制率，取2次測定的抑制率的平均值作為最終抑制率。

1.7 統計學方法

采用SPSS 10.0統計軟件，數據處理用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZCF清除DPPH自由基實驗結果

以DPPH·清除率對ZCF濃度作圖，發現ZCF及VC對DPPH ·有較好的清除作用，且ZCF對DPPH·的清除作用與ZCF及VC的添加量呈正相關，量效關系顯著。線性回歸方程為y = 17.93 x-3.31，r2= 0.9951。得出ZCF的半數清除濃度IC50= 0.017 mg/ml。同法算得VC的半數清除濃度IC50= 0.01 mg/ml。結果見圖1。

圖1 ZCF清除DPPH·實驗結果

2.2 ZCF對培養的乳鼠心肌細胞缺氧—復氧損傷的保護作用

2.2.1 MTT測定結果 ZCF劑量低于12.5 μg/ml劑量組時，對心肌細胞缺氧—復氧損傷的抑制率在50%左右。結果見表1。

表1 不同濃度芳香新塔花總黃酮

2.2.2 MDA測定結果 與正常組比較，模型組的MDA水平顯著降低(P﹤0.01)，說明模型成立。與模型組比較，ZCF各劑量組MDA的量均下降且呈劑量依賴關系，高、中、低三個劑量組MDA與模型組的差異非常顯著(P﹤0.01)。結果見表2。

表2 ZCF對培養的乳鼠心肌細胞缺氧—

3 討論

黃酮類化合物亦稱類黃酮或生物類黃酮，主要是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物，其基本結構式由兩個苯環(A和B)通過中間雜環的吡喃或吡喃酮(C)相連接，具有15個碳原子的多元酚化合物，廣泛存在自然植物中，有多種生物學活性。近年來國內外學者對其進行了大量的研究，證實黃酮類化合物具有抗自由基、抗腫瘤、抗病毒作用，對心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常有保護作用，此外，還有降壓、降血脂、抑制血小板聚集等多種藥理作用?，F已證明心血管疾病的發生和發展與自由基對心肌組織細胞的損傷關系密切。DPPH·是一種穩定存在的有機自由基，由于苯環的內軛和位阻及硝基的吸電子作用，呈現紫色被還原后變為淺黃色，通過測定反應體系在517nm附近的吸收峰的下降程度可以直接評價其抗氧化活性，變化程度與自由基清除程度呈線性關系，這種方法廣泛用于植物材料的總抗氧化活性的評價和抗氧化劑的篩選。本文試驗結果顯示，ZCF的IC50為0.017 mg/ml，而VC的IC50為0.01 mg/ml。說明ZCF具有較強的自由基清除作用。

心肌細胞缺氧—復氧模型可分別造成模擬心肌缺血與缺血后再灌注損傷模型，而在此模型中自由基損傷起著關鍵性作用[13]，心肌缺血—再灌注后，機體通過多種途徑產生氧自由基，氧自由基介導的細胞膜及亞細胞膜脂質過氧化是心肌缺血再灌注損傷的重要環節，而MDA是自由基攻擊生物膜引發脂質過氧化反應的產物，其量可反映脂質過氧化程度，可作為評價氧自由基攻擊程度的指標[14]。在本實驗中，心肌細胞在缺氧—復氧后，培養液中MDA的量顯著增加，而加入ZCF后，MDA含量均有明顯下降，表明ZCF能提高心肌細胞抗氧化能力，對心肌細胞缺氧—復氧具有一定的保護作用。

本實驗采用DPPH·清除活性方法來評價其對自由基的清除能力，并通過ZCF對培養乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用的影響，利用MDA的含量來觀察細胞受自由基攻擊程度，結果提示ZCF保護心肌損傷的機制可能與其抑制脂質過氧化，增強心肌細胞抗氧化能力有關。

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