芳香新塔花黃酮抗氧化活性及對大鼠乳鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用

廖晶晶 徐建國 楊偉俊 劉沖 地力努爾 滿爾哈巴

唇形科新塔花屬ZiziphoraL.在中國分布4種，均產(chǎn)新疆，其中芳香新塔花(Z.clinopodioidesLam.)資源最為豐富，生長于南北疆各山區(qū)的山地草地、礫石質(zhì)坡地及半荒漠草灘上。由于其獨特的芳香氣味，也是一種牛羊等牲畜喜食的牧草。芳香新塔花藥用地上部分，系維吾爾醫(yī)和哈薩克醫(yī)習(xí)用藥材，性“二級干寒”。芳香新塔花具有強心利濕，理氣化痰，消炎散結(jié)之功能，用于心臟病，氣短多汗，水腫，氣管炎等疾患[1]；也可用于感冒發(fā)熱，高血壓，心悸失眠等癥[2]。中醫(yī)臨床上也用于治療高血壓以及心肌缺血[3，4]。芳香新塔花具強烈的芳香氣味，地上部分含揮發(fā)油、萜類、生物堿、黃酮類等[5-9]。課題組從事芳香新塔花藥材繁育、規(guī)范化種植、化學(xué)研究及新藥開發(fā)等方面的研究工作多年，首次起草并制定了芳香新塔花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10]。通過對中國新塔花屬進行系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)，芳香新塔花具有顯著的藥理活性[11]，采用藥效活性追蹤的研究方法，從具有活性的部位中分離得到了一系列黃酮類化合物[9]，并采用溶劑提取、大孔吸附樹脂分離純化得到芳香新塔花總黃酮有效部位(Z. clinopodioides flavonoids，ZCF)。本實驗通過研究ZCF體外抗氧化活性以及對缺氧—復(fù)氧損傷和氧化損傷的心肌細胞的影響，為進一步探索藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠乳鼠(出生1～3天)，雌雄不限，均由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：新醫(yī)動字SYXK(新)2003-0001。

1.2 藥物

芳香新塔花黃酮(ZCF)，新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥研究室制備，純度71.0%，黃色粉末。

1.3 試劑

二苯代苦味酰自由基 (2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl，DPPH·)，購自美國Sigma公司。MTT，Amresco公司，批號：080717。胰酶，Amresco0458，批號：081011。鏈霉素，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號081112。DMEM培養(yǎng)粉(高糖、低糖)，Invitrogen Corporation產(chǎn)品，批號：081004。注射用氨芐西林鈉，中諾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：081120。其它所用試劑均為分析純。丙二醛(MDA)測試盒，批號：090103，100T，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.4 儀器

DG-5031型酶聯(lián)免疫檢測儀，華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Shimadzu UV-2501 紫外可見分光光度計(日本島津制造所)；BS124S電子天平(塞多利斯)；。

1.5 ZCF清除 DPPH·實驗

精確吸取ZCF貯備液，用乙醇稀釋為0.01 mg/ml、0.0125 mg/ml、0.0167 mg/ml、0.025 mg/ml、0.05 mg/ml的系列溶液，取各濃度溶液2 ml，加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·，搖勻，反應(yīng)30 分鐘 后，在紫外可見分光光度計上，517 nm波長處測定吸收值，記錄吸光度值為A樣品。用2 ml無水乙醇加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·溶液為空白對照，搖勻，反應(yīng)30 分鐘測得的吸光度為A空白對照，計算公式為：DPPH·清除率(%)=[1-A樣品/A空白對照]×100%。

同上法，測定不同濃度維生素C(VC)溶液的A樣品VC，A空白對照VC。

1.6 ZCF對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用[12]

1.6.1 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 出生1～3天SD大鼠乳鼠，無菌取出心臟，冷PBS溶液清洗后剪碎成約1～3 mm3的小塊，0.25%胰酶分次消化，再離心分離細胞，用DMEM(含10%胎牛血清)懸浮轉(zhuǎn)移并接種于培養(yǎng)瓶中，差速貼壁純化法，除去成纖維細胞。初步純化后的乳鼠心肌細胞懸液(1×105/ml)分別接種并培養(yǎng)3～4天，用于實驗。

1.6.2 細胞存活率實驗 心肌細胞與不同濃度的藥物共育24 小時后，棄去培養(yǎng)液，每孔加無血清的DMEM 180 μl和MTT 20 μl，培養(yǎng)4 小時，除去上清，每孔加DMSO 150 μl，混合均勻后，10 分鐘內(nèi)在570 nm處測吸光度(A)值。

1.6.3 缺氧—復(fù)氧模型的建立 心肌細胞培養(yǎng)72 小時后，用缺氧液(預(yù)先用高濃度氮氣飽和的培養(yǎng)液)置換正常培養(yǎng)液，放入缺氧培養(yǎng)箱(氮氣99.99%)，缺氧120分鐘，再用模擬再灌注液置換復(fù)氧液(預(yù)先用純氧飽和培養(yǎng)液)于5% CO2、37℃溫箱中復(fù)氧60分鐘，用硫代巴比妥酸顯色法測MDA的量。

1.6.4 試藥對乳鼠心肌細胞缺氧—復(fù)氧的影響 由細胞存活率實驗確定ZCF實驗劑量，并將實驗分為6組：正常細胞培養(yǎng)組(培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育3 小時結(jié)束實驗)；缺氧—復(fù)氧損傷模型組(缺氧2 小時，復(fù)氧1小時)；缺氧—復(fù)氧損傷+ZCF各劑量組(缺氧2 小時，復(fù)氧1 小時，缺氧—復(fù)氧時均給藥)。以不加試藥的細胞培養(yǎng)液孔的吸光度均值與加試藥各孔的吸光度均值之比作為抑制率，取2次測定的抑制率的平均值作為最終抑制率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)處理用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZCF清除DPPH自由基實驗結(jié)果

以DPPH·清除率對ZCF濃度作圖，發(fā)現(xiàn)ZCF及VC對DPPH ·有較好的清除作用，且ZCF對DPPH·的清除作用與ZCF及VC的添加量呈正相關(guān)，量效關(guān)系顯著。線性回歸方程為y = 17.93 x-3.31，r2= 0.9951。得出ZCF的半數(shù)清除濃度IC50= 0.017 mg/ml。同法算得VC的半數(shù)清除濃度IC50= 0.01 mg/ml。結(jié)果見圖1。

圖1 ZCF清除DPPH·實驗結(jié)果

2.2 ZCF對培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞缺氧—復(fù)氧損傷的保護作用

2.2.1 MTT測定結(jié)果 ZCF劑量低于12.5 μg/ml劑量組時，對心肌細胞缺氧—復(fù)氧損傷的抑制率在50%左右。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度芳香新塔花總黃酮

2.2.2 MDA測定結(jié)果 與正常組比較，模型組的MDA水平顯著降低(P﹤0.01)，說明模型成立。與模型組比較，ZCF各劑量組MDA的量均下降且呈劑量依賴關(guān)系，高、中、低三個劑量組MDA與模型組的差異非常顯著(P﹤0.01)。結(jié)果見表2。

表2 ZCF對培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞缺氧—

3 討論

黃酮類化合物亦稱類黃酮或生物類黃酮，主要是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物，其基本結(jié)構(gòu)式由兩個苯環(huán)(A和B)通過中間雜環(huán)的吡喃或吡喃酮(C)相連接，具有15個碳原子的多元酚化合物，廣泛存在自然植物中，有多種生物學(xué)活性。近年來國內(nèi)外學(xué)者對其進行了大量的研究，證實黃酮類化合物具有抗自由基、抗腫瘤、抗病毒作用，對心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常有保護作用，此外，還有降壓、降血脂、抑制血小板聚集等多種藥理作用。現(xiàn)已證明心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展與自由基對心肌組織細胞的損傷關(guān)系密切。DPPH·是一種穩(wěn)定存在的有機自由基，由于苯環(huán)的內(nèi)軛和位阻及硝基的吸電子作用，呈現(xiàn)紫色被還原后變?yōu)闇\黃色，通過測定反應(yīng)體系在517nm附近的吸收峰的下降程度可以直接評價其抗氧化活性，變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，這種方法廣泛用于植物材料的總抗氧化活性的評價和抗氧化劑的篩選。本文試驗結(jié)果顯示，ZCF的IC50為0.017 mg/ml，而VC的IC50為0.01 mg/ml。說明ZCF具有較強的自由基清除作用。

心肌細胞缺氧—復(fù)氧模型可分別造成模擬心肌缺血與缺血后再灌注損傷模型，而在此模型中自由基損傷起著關(guān)鍵性作用[13]，心肌缺血—再灌注后，機體通過多種途徑產(chǎn)生氧自由基，氧自由基介導(dǎo)的細胞膜及亞細胞膜脂質(zhì)過氧化是心肌缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，而MDA是自由基攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其量可反映脂質(zhì)過氧化程度，可作為評價氧自由基攻擊程度的指標(biāo)[14]。在本實驗中，心肌細胞在缺氧—復(fù)氧后，培養(yǎng)液中MDA的量顯著增加，而加入ZCF后，MDA含量均有明顯下降，表明ZCF能提高心肌細胞抗氧化能力，對心肌細胞缺氧—復(fù)氧具有一定的保護作用。

本實驗采用DPPH·清除活性方法來評價其對自由基的清除能力，并通過ZCF對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用的影響，利用MDA的含量來觀察細胞受自由基攻擊程度，結(jié)果提示ZCF保護心肌損傷的機制可能與其抑制脂質(zhì)過氧化，增強心肌細胞抗氧化能力有關(guān)。

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