miRNA的研究進展及其展望

姜雪鷗，鐘金城

（動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，西南民族大學，四川成都610041）

小分子DNA（miRNA）是一類存在于動植物體內、大小為21～25 nt的內源性非編碼單鏈小分子RNA，對生物體轉錄后的基因表達調控起關鍵作用［1］。1993年，首次在秀麗隱桿線蟲中發現miRNA let-4；7年后，在果蠅中發現第2個miRNA let-7。在進化中的保守性分析使科學家驚異地發現miRNA let-7的形成至少需要有Drosha/DGCR8（Pasha）、Dicer等2種RNA酶（RNaseⅢ）的參與。Drosha/DGCR8定位于細胞核內，它能剪切miRNA前體轉錄物（pri-miRNA），從而釋放出具有發夾結構、大小為70 nt左右的pre-miRNA，后者在轉運受體Exportin-5（Exp5）的作用下被轉運至細胞質，然后被胞質中的另一種RNaseⅢ蛋白Dicer剪切，最終被加工成成熟的miRNA［2］。動物的miRNA位于前體mRNA的內含子中，這種安排將使mRNA基因和內含子中miRNA共同轉錄。近年來，發現和鑒定的miRNAs越來越多，但植物miRNAs僅占很小一部分，且主要集中于擬南芥和水稻等少數模式植物中，植物miRNA的靶基因大多編碼轉錄因子，與植物的生長、發育密切相關；而在動物和人中發現大量miRNA，已證實在動物的生長、發育和疾病發生等過程中起重要作用。

1 miRNA的生物功能

1.1 真核生物

近幾年來，人們對miRNA的研究方興未艾，進展十分迅速。有一些研究報道指出，miRNA在調節植物對環境脅迫如干旱、鹽害和養分的脅迫反應等方面起著重要的作用［3］。成熟的miRNA先與一種稱為RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的復合物結合，再特異性地與目標mRNA結合，引起靶mRNA的降解。由于植物miRNA與其靶mRNA具有很高的堿基互補性，因而植物miRNA的作用方式可能更像小分子RNA干涉（small interfering RNA,siRNA），即RNA干涉對靶基因進行降解，miRNA所調節的靶基因控制著植物的根、葉、花等形態發生，細胞分化，輸導組織形成等植物生長發育的各個方面，大多數miRNA通過調節轉錄因子影響細胞分化和器官發生［4］。

與植物相反，在動物細胞中大多數miRNA與其靶mRNA并不完全互補，miRNA則通過與對應mRNA的3′端非翻譯區（3′UTR）結合阻止轉錄后的翻譯，從而起到調節基因表達的作用。對動物的研究，從線蟲時序發育中lin-4、let-7的功能被揭示以來，miRNA功能研究不斷得益于miRNA基因功能喪失的突變體。bantam基因突變果蠅由于細胞數量減少（而不是細胞體積減?。┒斐杀纫吧偷膫€體小，相反，bantam過量表達則會導致果蠅翅膀和眼組織過度生長［5］。此后，Brennecke［6］等證實bantam miRNA通過控制前凋亡基因hid來促進細胞增殖和抑制凋亡。mir-14的缺陷加速了由細胞死亡激活劑Reaper誘導的細胞死亡，并導致了應急反應和脂肪代謝缺陷［7］，發現mir-14與細胞凋亡和脂肪代謝有關。而迄今為止，已經預測出上千個哺乳動物miRNA的靶基因，它們對參與調控基因有著很強的嗜性，例如F$′G參與翻譯抑制的蛋白、miRNA的組成成分和編碼的轉錄因子的基因等，但也有許多編碼結構蛋白和酶的基因，暗示miRNA在多種生理過程中具有調控作用。

在人類miRNA的研究中，Calin等［8］發現約有50%的miRNAs基因位于與腫瘤相關的染色體區域內，如染色體發生雜合性缺失的區域、發生重排和擴增及斷裂點的區域等，提示miRNA基因的表達可能與腫瘤發生相關。此外，已有研究表明，miRNA對細胞的增殖、分化、凋亡和癌癥發生有重要的調控作用［9］，其在正常組織和腫瘤組織中的表達有著顯著差異，有些miRNA會在腫瘤組織中有低表達，有些則在腫瘤組織中有高表達［10］，這說明miRNA在腫瘤發生過程中起了至關重要的作用。Calin等［11］研究發現患有一種成年型B細胞慢性淋巴型白血?。–LL）的病人常有mir-15a、mir-16基因簇的缺失或表達下調，65%的CLL病人、50%的外套細胞淋巴瘤病人、16%～40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13 q14位點的缺失，顯示miRNA可能起到抑癌基因作用。進一步研究發現mir-15a和mir-16可通過抑制BCL-2基因的表達水平而阻止癌癥的發生。Lu等［12］研究發現，較少的miRNAs（約200個）表達譜就可以對人類癌癥進行診斷和分類，與mRNA表達譜（5%）相比，其準確度高達70%。近來發現的一簇miRNA，mir-17-92多順反子，定位于人B細胞瘤中DNA擴增區域，對其研究結果表明，mir-17-92簇可能為潛在的致癌基因。Takamizawa［13］等發現，肺癌患者中 let-7miRNA 表達水平降低，且let-7水平降低的患者在手術切除后存活時間更短；此外，在體外高表達let-7的肺腺癌細胞系A549可抑制肺癌細胞的生長。Johnson［14］等研究表明，let-7 miRNA在線蟲和人瘤細胞系中負調控RasGTP酶癌基因家族，暗示let-7可能是腫瘤抑制基因。Chan［15］等發現mir-21在惡性腦瘤和神經膠質細胞瘤中顯著高表達，并且mir-21可能通過阻止關鍵凋亡相關基因的表達而促進惡性表型。

1.2 原核生物

miRNA除了在多細胞生物中發揮重要的調節作用外，還廣泛存在于單細胞生物中。單細胞生物中的miRNA，都可在體內和體外對靶標mRNA進行切割，這與植物中發現的miRNA一致，但與多細胞生物中的miRNA具有顯著差異，這提示miRNA通路形成于這兩條進化支系分離之前，而且單細胞生物中的miRNA是獨立進化而來的［16］。近年來的研究表明，一些病毒也編碼大量的miRNAs，它們在病毒的復制和感染過程中發揮著至關重要的作用［17］。

2 miRNA的預測與鑒定

自從第一個miRNA發現以來，已經出現了多種鑒定、預測、分析miRNA的方法，這些方法各有優缺點，主要有以下幾種方法。

2.1 cDNA文庫法

該方法是首先從細胞組織中提取總RNA，用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，回收大小為20～25個核苷酸的RNA分子，利用T4連接酶，直接將人工合成的3′和5′接頭連接到RNA上，經PCR反轉錄擴增這些序列，建立miRNAs的cDNA文庫，進行克隆、測序，然后用生物信息學軟件定位其在基因組中的位置，并驗證是否具有發夾結構的前體和該發夾結構在其它物種中的保守性，最后將具有發夾結構的小分子RNA進行Northern雜交等來檢測其表達情況，將符合miRNA標準的小分子RNA鑒定為新的 miRNA［18］。

2.2 生物信息學分析

表1 第一代miRNA靶基因預測軟件

表2 第二代miRNA靶基因預測軟件

動植物中的miRNA可以用直接克隆的方法加以鑒定。一些實驗室已經建立了不同組織、不同發育時期或不同生長條件下的miRNA基因文庫［21］。但該方法對低豐度miRNAs的鑒定卻相當困難，且不可避免大量的重復測序［22］。由于大部分成熟的miRNAs序列是高度保守的，所以可以通過表達序列標簽（EST）和基因組序列（GSS）的生物信息學比對，來搜索或預測在其他生物中的未知miRNAs，再根據miRNAs與靶基因mRNAs完全或部分互補的特性預測其靶基因［23］。實驗證明，生物信息學方法是預測和發現新的miRNA的一個有效方法，它是以基因組序列和計算機程序鑒定為基礎的方法［24］。目前，通過各種計算機軟件以及其他計算工具已經成功地預測和鑒定了動植物中的大多數miRNA［25］。近年來，許多實驗室開發出了應用于預測miRNA及其靶基因的計算機軟件（表 1，表 2）［26］，這些軟件各有優缺點，主要依據miRNA靶位點的保守性、miRNA與其靶位點的互補性、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩定性及附近序列的二級結構等信息編寫其程序。其中TargetScan提出了“種子區”的概念，增加了預測的精確度；miRanda是將miRNA-mRNA之間的序列匹配，保守性及熱穩定性作為計算參數，有比較好的檢出率，但是假陽性率也較高；DIANA-microT則主要考慮miRNA調控單個靶基因的情況，同時考慮中央突起以及miRNA在3′端與mRNA的結合；RNAhybrid的研究重點在RNA二級結構預測方面，能夠更快速準確地計算miRNA-mRNA雙鏈的自由能，降低了假陽性率；部分學者的研究結果顯示，PicTar和TargetScan這兩種軟件的預測方法、預測的靶位點在整體上是相似的，而與其他多數軟件的預測結果則相去甚遠。但RNA22與其他算法不同，不考慮物種間的保守性，檢出率較高。通過比較分析這些miRNA和靶基因預測軟件，大致可將其分為第一代和第二代兩大類預測軟件。第一代miRNA及其靶基因預測軟件主要側重以下3點：①靶基因非翻譯區的跨物種保守性；②靶基因與種子序列的互補性；③miRNA靶基因二聚體熱力學穩定性。而第二代預測軟件是在第一代預測軟件的基礎上大多從“突破物種間保守”來設計的，如microTar、miTarget等引入了機器學習方法來提取特征參數，嘗試從統計學的角度更好地反應miRNA與靶基因相互作用的真實過程，以彌補保守性這個限制而丟失了的靶基因，取得了一定程度的成功。目前，很難評價哪種方法是最好的。盡管各種方法的基本原理都是相關的，但由于動物miRNA的靶位點很小，而且miRNA與靶位點是不完全互補，因此計算方法中極小的差別就能產生相差很遠的預測結果。并且對于計算位點保守性的得分標準，3′UTR的鄰位序列的定義和分析以及對3′UTR的長度和其核苷酸組成考慮等，不同方法間都有顯著的差異，這也會造成結果的差異。

3 miRNA研究中存在的問題及展望

目前已鑒定的miRNA無論是在植物，還是動物中，其數目都非常的有限。因此，還有許多其他的miRNA有待于發現并闡明其功能。例如，現已有研究人員對于牛、羊、豬、家犬、大猩猩等哺乳動物的miRNA，在NCBI數據庫中注冊了其分子信息，可對這些哺乳動物進行深入的研究，這些miRNA在其各個時期都可能起著重要的作用，也可對其他物種進行研究，這為遺傳學提供了新的研究方向與思想；而針對miRNA在一些疑難疾病，特別是腫瘤和癌癥的發病機理中，隨著研究的不斷深入，這類小分子在生命活動中具有廣泛的調節功能，同時有助于闡明藥物反應的個體機制，也為藥物設計與針對性治療提供了潛在目標。

目前，一些實驗室已經建立了不同組織、不同發育時期或不同生長條件下的miRNA基因文庫，發現了許多miRNA。但在其功能的分析、最終的表型與表達等方面的研究，還是較少的，一方面是因為研究miRNA的成本太高，所需時間較長；另一方面是還沒有真正地找到一種符合多數miRNA的研究方案。如何建立一種高效、準確地搜尋miRNA的方法是當前的研究重點。生物體中已知miRNA通常用的是直接克隆、芯片技術等生物學實驗方法加以鑒定、驗證的。其中直接克隆法針對鑒定那些高豐度的miRNAs有顯著的效果，而對于豐度低、具有組織和階段表達特異性的miRNA，以及由于自身的物理因素（如轉錄后修飾等）［19］而很難通過克隆的方法得到的miRNA，都很難用克隆方法進行鑒定，而且不可避免大量的重復測序，所以通過建cDNA文庫的方法尋找miRNA具有明顯的局限性。此外，一些內源性的miRNA以及mRNA和其他非編碼RNA的降解產物對克隆也具有一定的干擾作用［20］。而芯片技術的應用是通過雜交，發現大量的miRNA分子，從而可以對這些被發現的miRNA分子進行下一步的分析，但是這種方法的缺點是無法直接得到miRNA靶基因、基因位置和前體序列等信息［27］，這會影響對miRNA分子研究的后續工作。大部分成熟miRNAs序列在生物中是高度保守的。近年來，通過生物信息學方法來進行分析和預測，除了在對比過程中就能了解前體信息外，還能了解到其靶基因信息，而所得到的miRNA候選基因序列，大多都與已知的miRNAs序列高度相似，這說明根據miRNA的保守性和物種之間基因組的同源性，用生物信息學理論和方法篩選、尋找新的miRNA候選序列的方法能夠在較短時間里尋找出一定量的新miRNA分子，速度快、通量大，是一條在生物體內尋找到更多miRNA分子的新思路和有效途徑。但是生物信息學方法也有不足之處，雖經多年來的發展，同源序列搜索法已經取得了很大成功，然而要搜索與已知miRNAs/per-miRNAs在序列上和結構上同源的miRNAs/per-miRNAs，需有已知的miRNAs/per-miRNAs為參照，對于不與已知miRNAs/per-miRNAs同源的miRNAs/permiRNAs則行不通。

綜上所述，無論是單純的生物實驗方法還是生物信息學方法，對于miRNA的研究都有優缺點，生物信息學分析得到的結果還需進一步的生物學實驗驗證，如果能夠充分地把計算機、生物信息學等預測方法和生物學實驗方法相互補充和有機結合，不但能夠減少miRNA靶基因尋找的盲目性，節約實驗成本，而且可以使人們能夠更有針對性地研究感興趣的miRNA，更加準確方便地闡明其在生命活動中的功能與意義。

目前，已對牛、羊、豬、家犬、人、大猩猩等哺乳動物的miRNA進行了較多的研究，在NCBI數據庫中注冊了其分子信息。通過對牛和羊已經注冊的miRNA序列進行分析得到的一些篩選標準為：①新預測miRNA的前體能折疊成發夾二級結構；②新預測的miRNA與成熟的miRNA只能存在0～3個堿基差異；③在miRNA中不能存在環狀結構；④miRNA中的A+U含量在30%～70%之間；⑤miRNA與其互補序列的差異不能多于6個；⑥發夾結構必須有較小的自由能。符合以上標準的序列可為以后預測到牛、羊等動物基因組中新的miRNA序列。

但在動植物中目前已鑒定出的miRNA，其數目非常有限。還有許多miRNA有待于發現并闡明其功能，這可能是今后遺傳學、醫學研究的一個新方向和熱點。

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