人參三醇組皂甙對人視網膜色素上皮細胞增生和DNA合成的抑制作用

李曉華,王作書,王瑞卿,張 妍,明 月*

(1.吉林大學第二醫院 眼科,吉林 長春130041;2.吉林省消防總隊醫院,吉林 長春130061)

人參三醇組皂甙(Panoxatriol saponins,PTS)是由西洋參根中提取,主要含有 Re、Rf、Rg1、Rg2和 Rh1,具有增強免疫功能、促進學習記憶、抗衰老、抗腫瘤、清除氧自由、改變碳水化合物和脂質代謝等多種生物學效應[1-3];本室以往研究已證實人參莖葉總皂甙(Ginsenoside of Stems and Leaves,GSL)(含 Rb2、Rc、Rd 、Re、Rf、Rg2)和西洋參根源人參二醇組皂甙(Rb1、Rb2、Rc、Rd)具有抑制 RPE 細胞增殖的作用,由于PTS與GSL的成分相近,我們進一步觀察了PTS對培養的人RPE細胞增生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

培養的RPE細胞來源于孕32周流產胎兒人胚眼,主要試劑包括:改良的Eagle培養液(Delbecco,s modified Eagle,s medium DMEM 培養液)(GIBCO),胎牛血清(FCS,GIBCO),溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(MTT,北京華美生物工程公司),二甲基亞砜(DMSO,國產分析純),3H-TdR購自北京原子能研究所,放射強度為1 mCi。西洋參根源PTS由吉林大學基礎醫學院天然藥物化學研究室惠贈,淡黃色粉末,實驗前用DMEM溶解配成不同濃度。

1.2 方法

1.2.1RPE細胞的培養 人胚眼球在無菌條件下,沿扁平部剪開,剔除前部組織、玻璃體及視網膜感覺部,后節眼杯用PBS液漂洗后在解剖顯微鏡下分成4塊展平后,放入DMEM培養液中,顯微鏡下剝離RPE層,將得到的 RPE置于0.25%胰蛋白酶(trypsin)中消化30 min,FCS終止消化,注吸法分離RPE,離心、清洗后接種于含20%FCS的DMEM 培養液,置于37℃,5%CO2的孵箱中培養。RPE細胞為貼附型細胞,取第5代用于實驗。

1.2.2藥物濃度與效應關系實驗 RPE細胞經酶消化后制成細胞密度2×104/ml細胞懸液,每孔2 ml接種于24孔塑料培養板,孵育24 h后加入PTS,使其終濃度為 0 、5、10、50、100、150、200、300、40、500 μ g/ml,每種濃度3孔,培養12 h后,更換成不含藥物的培養液繼續培養24 h,Trypsin消化制成細胞懸液,給藥組和對照組各取3孔臺盼藍染色計數,計算抑制率。細胞活力測定:取各樣本細胞懸液0.9 ml加入1%臺盼藍0.1ml,混勻,血細胞計數板盲法計數,著色細胞為死細胞,以活細胞數占計數細胞的百分比反應細胞活力。

1.2.3時間與藥物效應關系實驗 同上接種細胞,孵育24 h后加PTS使其終濃度200 μ g/ml,對照組加入等量的DMEM培養液。分別于培養12、24、48、72、96和120 h經Trypsin消化后臺盼藍染色計數,計算增生抑制率。

1.2.4MTT比色法 取密度為4×104/mlRPE細胞懸液200ul接種于96孔板,孵育24 h后棄液,加入含PTS的培養液,PTS終濃度分別為50、100、200、300 、400 μ g/ml,對照 組加入等量 DMEM 培養 液,每組3復孔。培養12 h后用培養液漂洗細胞1次,加入 5 mg/mlMTT(Sigma)10 μ l和 190 μ lDMEM,繼續培養 6 h,棄液 ,每孔加入 DMSO 100 μ l,振搖 10 min,用Bio-RAD550型酶聯免疫檢測儀在490 nm波長下讀取吸光值(A值),進行t檢驗并計算生存率和EC50。

1.2.53H-TdR摻入法步驟同1.2.4,給藥后培養24 h,每孔加入3H-TdR1 μ Ci,繼續培養 12h,Trypsin 消化制成細胞懸液,收集細胞于纖維濾膜,洗滌,涼干后置入閃爍瓶中,加入二甲苯閃爍液,用液化閃爍計數儀測定每分鐘計數值(counts per minute,CPM),進行t檢驗并計算摻入抑制率。

2 結果

2.1劑量-效應關系RPE細胞數隨PTS濃度增加而減少,PTS 在5 、10、50 、100、200、300 、400 、500 μ g/ml對細胞增生的抑制率依次為22.02%、37.00%、48.62%、64.53%、74.92%、81.96%、83.18%和82.26%。

2.2時間-效應關系貼壁生長良好的RPE細胞在給藥后12 h可見部分細胞脫落,在所觀察的12、24、48、72、96、120 h 點,與對照組相比 PTS 組 RPE 細胞增生的抑制率分別為37.93%、59.53%、74.64%、79.11%、80.91%和80.53%;于給藥后96 h內,其抑制效應隨時間而明顯增強,各組細胞活力均在90%以上。

2.3PTS對RPE細胞增殖的抑制作用PTS的A值明顯低于對照組(見表 1),其中50 μ g/ml組 P＜0.05,其余 4 組(100、200、300、400 μ g/ml)P ＜0.01:PTS 對人胚RPE細胞的EC50為64.3 μ g/ml。

表1 不同濃度PTS作用下RPE的生存率

2.4PTS對RPE細胞DNA合成的抑制作用PTS組CPM值隨藥物濃度增加而降低(見表2)。

3 討論

增殖性玻璃體視網膜病變(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)被認為是眼內炎癥、孔源性視網膜脫離(Retinal Detachment,RD)、外傷、眼內手術后的損傷修復過程,是由多種細胞、生長因子、細胞因子、膠原和細胞外基質相互作用的病理過程。病理學研究表明視網膜色素上皮細胞(RPE)是發生PVR時最重要的細胞,RPE在病理情況下可移行至玻璃體內并在玻璃體內散布、增生、合成膠原及其它細胞基質,并具有成纖維細胞樣作用[4]。PVR是引起視力障礙甚至失明的嚴重眼病之一,是導致RD手術失敗的最常見原因。玻璃體手術雖可有效治療PVR,但術后仍有一些病人復發,最終導致視力喪失,探討PVR的藥物治療逐漸成為國內外眼科工作者的研究熱點。本實驗通過細胞計數法、MTT比色法和3HTdR摻入法探討PTS對RPE細胞增生的影響,結果發現PTS對培養人胚RPE細胞增生具有抑制作用,在一定時間(96小時)和劑量范圍內(50 μ g/ml至400 μ g/ml)存在時間依賴和劑量依賴關系。我們還發現貼壁生長良好的RPE細胞在給藥后12小時即可見部分細胞脫落,貼附是貼附型細胞生長增殖的條件之一,通常細胞表面有由細胞分泌的糖蛋白膜,即細外衣,它對細胞運動尤其是貼附于支持物生長有重要作用[5]。細胞外衣的性質與細胞物質膜電位、酸堿失衡有關,改變細胞外衣的性質可使細胞由支持物上脫落下來。有研究表明RPE細胞中游離鈣的濃度調節細胞吞噬功能狀態、細胞增殖及細胞與基底膜的粘附力[6];同時鈣離子還是細胞收縮、吞噬、物質轉運與代謝及酶活性調節的基礎調控者[7]。大量實驗證實PTS和所含單體Rg1、Re具有抑制細胞外鈣內流降低膜電位[8-10];此外,PTS中單體Rg2還具有抑制鈉內流的作用[11]。由此推測PTS可能可能通過阻滯鈣通道改變細胞內鈣濃度引起細胞粘附力、增殖力下降,同時干擾細胞內酶活性和物質代謝;同時通過抑制鈣和鈉離子內流改變膜電位抑制RPE過度增增殖。由于正常活細胞線粒體內活性脫氫酶可將MTT還原為紫色的甲潛(formazan),且細胞的存活數與其產生的甲潛的A值之間存在線性關系。MTT比色法發現給藥組細胞甲潛產生量少于對照組,A值明顯低于對照組,細胞生存率隨藥物濃度增加而下降,進一步證實PTS可干擾細胞代謝。Popovich等證實PTS可導致人白血病細胞THP-1的DNA斷裂[12],本實驗通過3H-TRP摻入實驗證實PTS可抑制RPE細胞DNA合成,其抑制作用在一定濃度范圍內藥物隨濃度的增加而增強。

表2 人胚RPE細胞在PTS作用下DNA合成抑制率

PTS可通過抑制DNA合成,并可能通過抑制鈣和鈉的內流、改變膜電位、干擾細胞代謝、改變細胞外衣的性質而抑制RPE細胞增殖。PTS作用與PDS相似,PTS能否抑制RNA、膠原合成及對PVR動物的治療作用尚在研究中,PTS有望成為治療PVR的有效藥物。

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