黃芪丹參合劑對小鼠CCl4急性肝損傷保護作用的實驗研究

劉文藝,吳 鴻

(遵義醫學院附屬醫院肝膽外科,貴州遵義563003)

急性肝損傷是急性肝功能衰竭的基礎,嚴重或持續的肝損傷最終導致肝功能衰竭。引起肝急性損傷的原因很多,主要有病毒感染、用藥不當、食物添加劑、乙醇攝入過多及接觸、食入有毒食物、放射性損傷等[1]。黃芪丹參復方制劑的主要成分黃芪及其有效成分黃芪皂苷能保護細胞結構特別是線粒體結構,提高細胞內超氧化物歧化酶活性,減輕氧自由基對細胞膜的損傷;丹參可抑制白細胞的趨化性和聚集反應,防止和驅散白細胞在毛細血管內的聚集,因而減少氧自由基的產生;黃芪丹參復方制劑可能通過增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力,減輕氧自由基損傷[2],但其是否具有保護肝細胞的作用尚未確定。本實驗旨在用CCl4復制急性肝損傷模型,以觀察黃芪丹參合劑的保肝作用。本試驗研究黃芪丹參合劑對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 ICR雄性小鼠48只,清潔級,體重18-22 g,由第四軍醫大學實驗動物中心飼養。

1.1.2藥品和試劑 黃芪丹參合劑(由山西太行藥業股份有限公司提供,批號Z20090252)、CCl4(由國藥集團化學試劑有限公司提供,批號20061114)、橄欖油(由國藥集團化學試劑有限公司提供,批號F20040614)、甲醛(由國藥集團化學試劑有限公司提供,批號JH20060110)。

1.1.3儀器包括自動生化分析儀、組織包埋機、光學顯微鏡、組織自動脫水機、攤片機、烘片機、石蠟切片機等。

1.2 方法

1.2.1動物分組 將48只小鼠隨機分為正常組、CCl4模型組、黃芪丹參合劑低劑量組、黃芪丹參合劑高劑量組,每組12只。

1.2.2給藥方法 設定溫度為20-22℃,濕度為48-50%,置于實驗室4 d后進行試驗。自試驗之日起各黃芪丹參合劑組小鼠每天給與相應的中藥灌胃1次,灌胃量0.25 ml/10 g體重,給藥量見表 1。除黃芪丹參合劑高劑量組給藥量相當于成人常用量的70倍,而低劑量組相當常用量30倍。正常組和CCl4模型組給予等量蒸餾水,同樣每天灌胃1次,連續灌胃6 d后檢測指標。

1.2.3小鼠造模 最后一次給藥完畢1 h后,給予正常組腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg體重),其它三組小鼠均給予一次性腹腔注射CCl4(0.125%溶液,10 ml/kg體重)完成急性肝損傷小鼠造模[4]。

1.2.4肝組織取樣 造模成功1 d后稱小鼠體重,摘去眼球取血以自動生化分析儀作肝功能檢測,使用脊柱脫臼法處死,迅速稱取肝臟重量,計算肝指數(公式肝指數=肝臟重量/小鼠體重),留取肝組織樣本作病理學觀察。

1.2.5肝臟病理學觀察 留取相同部位約5 mm×5 mm×3 mm的肝組織,厚4 μ m,使用10%中性福爾馬林固定,逐級進行酒精脫水,最后石蠟包埋,作常規H-E染色,在光鏡下觀察肝臟樣品組織結構、肝細胞變性壞死和炎癥細胞浸潤等病理變化。

1.2.6數據分析方法 計量資料以s表示,用統計分析軟件SPSS14.0中的ANOVA程序進行單因素方差分析,P＜0.05提示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組肝指數比較[3,4]

由表1可見,模型組與正常組比較,差異無統計學意義(P＞0.05);黃芪丹參合劑組與模型組比較,肝指數之間差異亦無統計學意義。

表1 黃芪丹參合劑對小鼠肝指數的影響(s)

表1 黃芪丹參合劑對小鼠肝指數的影響(s)

組別 n 各組因灌胃死亡數(只)給藥量(g/kg.b.w)相當于生藥量(g/kg.b.w)肝指數正常組 7 5 - - 0.0491±0.00687模型組 7 5 - - 0.0489±0.00390低劑量組 7 5 1.33 10.50 0.0454±0.00509高劑量組 9 3 3.10 24.50 0.0497±0.00499

2.2 血清 TBiL、ALT、AST含量變化

由表2可見,模型組與正常組比較,差異無統計學意義(P＞0.05),各給藥組與模型組比較,所檢測的指標值差異亦無統計學意義(P＞0.05)。

表2 黃芪丹參合劑對小鼠 CCl4急性肝損傷的TBiL、ALT、AST含量的影響(s)

表2 黃芪丹參合劑對小鼠 CCl4急性肝損傷的TBiL、ALT、AST含量的影響(s)

組別 n TBiL(mmol/L)ALT(IU/L)AST(IU/L)正常組 7 9.20±1.62 43.00±8.28 103.60±7.44模型組 7 7.72±2.03 52.00±14.78 138.50±40.55低劑量組 7 8.04±1.30 133.80±81.34 140.20±10.76高劑量組 9 8.68±0.73 45.00±21.86 157.40±63.44

2.3 各組肝臟樣品的病理改變

2.3.1正常組肝臟病理 小鼠的肝臟結構正常,肝索排列規則,總體觀察,肝細胞形態無改變。

2.3.2模型組肝臟病理 小鼠的肝臟結構紊亂,小葉間界限不清,肝細胞有較廣泛的胞漿疏松,部分呈小泡狀脂肪變性;肝竇擴張,庫普佛細胞增生。

2.3.3黃芪丹參合劑組肝臟病理 小鼠肝臟結構改變較輕,變性肝細胞的程度和范圍也略低,肝竇有不同程度的擴張,其中黃芪丹參合劑高劑量組小鼠的肝竇充血較明顯,詳見圖1。

圖1 小鼠的肝臟病理改變(HE,×200)

3 討論

肝細胞損傷的機制非常復雜,可因各種有害因子物質,例如病毒、藥物、乙醇、缺氧、免疫等作用于肝細胞,繼而產生一系列介質最終造成肝細胞損傷。肝細胞損傷大致可分為化學性和免疫性肝損傷,兩者也可相互作用。肝細胞損傷的化學機制主要通過細胞色素P450(CYP)及結合反映產生的中間代謝引起的,如細胞膜完整性發生改變、線立體功能失調、細胞內離子濃度變化以及自由基核降解酶的作用[5,6]。肝細胞損傷的免疫機制通過細胞因子、NO、補體及變態反應等引起損傷,病理性細胞凋亡也屬于免疫損傷機制之一。黃芪丹參復方制劑可能通過增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力,減輕氧自由基損傷。本研究結果顯示,其對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用不確切。

[1]中華醫學會消化病學分會肝膽疾病協作組.急性藥物性肝損傷診治建議(草案)[J].中華消化雜志,2007(11):112.

[2]Huang YS Genetic polymorphisms of drug-metabolizing enzymes and the susceptibility to antituberculosis drug-induced liver injury 2007(01):34-35.

[3]王寶恩,張定鳳主編.現代肝臟病學[M].北京:科學出版社,2003.

[4]Xinhui Tang,Jing Gao,Yanping Wang.Effective protection of Terminalia catappa L.leaves from damage-induced by carbon tetrachloride in liver mitochondria[J].Journal of Nutritional Biochemistry,2006,17(3):177.

[5]湯新慧,高 靜.實驗性肝損傷的損傷機制[J].中西醫結合肝病雜志,2002,12(1):53.

[6]Xin Hui Tang,Jing Gao,Feng Fang.Hepatoprotection of oleanolic acid is related to its inhibition onmitochondrial permeability transition[J].American Journal of Chin Med,2005,33(4):627.