雞血藤黃酮類有效部位對人非小細胞肺癌A549細胞凋亡與線粒體膜電位的影響

王 燕 李 萍 林 燕 趙京霞 劉 欣 何 薇 梁代英 羅曉琴 王笑民*

(1.北京市中醫研究所，北京 100010;2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010)

雞血藤(spatholobus suberectus dunn)黃酮類有效部位是養血活血類中藥，常用于腫瘤患者。研究［1-2］表明，雞血藤提取物在體內、體外試驗中均呈現抗腫瘤作用。采用聚酰胺柱色譜法從雞血藤醇提取物中分離獲得的富含黃酮類化合物組分“雞血藤黃酮類有效部 位 (spatholobus suberectus column extract，SSCE)”，SSCE在體外試驗中抑制腫瘤活性最強［3］。

本試驗組選用敏感的肺癌細胞系A549細胞株作為研究對象，觀察SSCE作用后細胞凋亡的情況及線粒體膜電位的改變，以探討雞血藤抗腫瘤的物質基礎，為尋找新的高效低毒的新型抗癌先導化合物提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

恒溫CO2培養箱(日本三洋公司)，SA1000酶標儀(奧地利 Asyshitech公司)，激光共聚焦顯微鏡FV500(日本Olympus公司)。

1.2 藥品與試劑

SSCE由北京市中醫研究所藥化室制備。F12培養基(美國HyClone公司);胎牛血清(美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Gibco公司);細胞增生試劑盒cell counting kit-8(CCK-8，日本同仁化學公司)，Annexin V-PI雙染試劑盒(Cat K 101-25，美國BioVision公司)，Hoechst染料(日本同仁化學公司)，JC-1染料(北京碧云天公司)，Mitotracker Red(Cat PA-3017，瑞士Lonza公司)。

1.3 細胞系及細胞培養

人肺腺癌A549細胞系購自協和細胞中心。細胞培養條件:F12培養基，含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養。

1.4 細胞活性檢測

采用CCK-8檢測，取對數生長期細胞制成單細胞懸液，調細胞個數為2×107/L，接種于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h后，吸出上清液，每孔加入100 μL含SSCE或無SSCE的培養液。

實驗分為4組，分別為:①對照組:A549細胞+完全F12培養;②低劑量組:A549細胞+40 mg/L SSCE;③中劑量組:A549細胞+80 mg/L SSCE;④高劑量組:A549細胞+160 mg/L SSCE。每組至少設3個副孔，培養24、48、72 h 后，每孔加入 10 μL CCk-8 溶液，培養 4 h，在酶標儀上測450 nm處吸光度A，并計算細胞增生抑制率(inhibition rate，IR)，實驗重復3次。

細胞增生抑制率(%)=(1-實驗組A/對照組A)×100%。

1.5 細胞凋亡檢測

1)Annexin V-PI雙染法激光共聚焦顯微鏡觀察:細胞以1×105/mL傳送于Petri小皿中，分為對照組及SSCE 組(160 mg/L，作用24 h、48 h)，用 PBS洗2次，分別加入 100 μL 1 × Binding Buffer緩沖液，5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，室溫避光孵育 15 min，再加入400 μL 1×Binding Buffer緩沖液，激光共聚焦觀察。激發波長Ex=488 nm;發射波長Em=530 nm。

2)Hoechst染色倒置熒光顯微鏡觀察:將細胞傳送于提前放置好潔凈蓋玻片的24孔板中，細胞密度1×105/mL，待細胞貼壁后，向孔內加入SSCE(160 mg/L)，同時設正常對照組，SSCE作用24 h后，取出細胞爬片，于PBS溶液中漂洗3 min×3次，漂洗后于預冷的固定液中(甲醛與丙酮1∶1混合)固定細胞8 min，向固定好的細胞滴加 Hoechst33342(5 μmol/L 50 μL)，37℃孵育15 min，取載玻片，每片上滴加1滴防熒光淬滅劑，將細胞片扣于載玻片上，于正置熒光顯微鏡下觀察細胞核變化。

1.6 線粒體檢測

1)JC-1染色激光共聚焦顯微鏡觀察:細胞以1×105/mL傳送于Petri小皿中，分為對照組及SSCE組(160、80、40 mg/L，作用 24 h)，用 PBS 洗 2 次，加入JC-1(50 mg/L，200 μL)，37 ℃孵育 20 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。JC-1是檢測線粒體膜電位的熒光探針，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產生綠色熒光。這樣就通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。

JC-1單體的最大激發波長為514 nm，最大發射波長為529 nm;JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發波長為585 nm，最大發射波長為590 nm。實際觀察時，使用常規的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。用軟件計算紅綠熒光比值。

2)Mitotracker Red染色激光共聚焦顯微鏡檢測:細胞以1×105/mL傳送于Petri小皿中，分為對照組及SSCE組(160 mg/L，作用24 h)，用 PBS洗2次，加入 Mitotracker(5 mg/L，200 μL)，37 ℃孵育 20 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 統計學方法

數據采用SPSS 16.0軟件處理，實驗數據以均數±標準差(±s)表示。組間比較采用折因方差分析和均數的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SSCE對A549細胞活性的影響

相同處理時間不同濃度SSCE作用后，對細胞活性的影響與對照組相比差異均有統計學意義，低、中、高3個劑量的 SSCE作用24 h后，抑制率分別為10.29%、31.52% 和42.75%;各劑量 SSCE 處理 48 h后，抑制率分別為 27.15%、38.85% 和 57.49%;各劑量 SSCE處理 72 h后，抑制率分別為 15.13%、15.10%和 37.52%，詳見表 1。

表1 不同濃度SSCE作用相同時間對A549細胞增生的影響Tab.1Effect of SSCE on the proliferation of A549 cells(±s)n=6

表1 不同濃度SSCE作用相同時間對A549細胞增生的影響Tab.1Effect of SSCE on the proliferation of A549 cells(±s)n=6

* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control;SSCE:spatholobus suberectus column extract;OD:optical density.In each group the time of reaction was the same，and the effects of different concentration of SSCE on cell proliferation were compared.

Group OD 24 h 48 h 72 h Control 0.639 ±0.011 2.280 ±0.190 3.299 ±0.231 160 mg/L 0.366 ±0.035＊＊ 0.969 ±0.107＊＊ 2.088 ±0.211＊＊80 mg/L 0.438 ±0.056＊＊ 1.394 ±0.158* 2.837 ±0.102*40 mg/L 0.574 ±0.081* 1.661 ±0.791* 2.836 ±0.107*

2.2 SSCE對細胞凋亡的影響

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。發生PS外翻的細胞能夠結合AnnexinV-FITC呈綠色熒光圖像。凋亡晚期和死亡細胞能夠被PI染成紅色。因此，未被染色的為正常細胞，單染綠色熒光的為早期凋亡，紅綠雙染的為晚期凋亡，單染紅色的為死亡細胞。SSCE在濃度160 mg/L作用于A549細胞24 h后，細胞單染綠色(圖1B)，表明發生了早期凋亡。作用48 h后，細胞呈紅綠雙染，表明為晚期凋亡(圖1D)。

圖1 SSCE作用24、48 h后Annexin V-PI染色激光共聚焦顯微鏡觀察PS外翻Fig.1 Immunofluorescence staining of Annexin V-PI in SSCE incubated A549 cells(600×)

在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，陽性對照組大量細胞的細胞核出現致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染(圖2A)，而SSCE組在濃度160 mg/L作用24 h，部分細胞核出現致密濃染(圖2B)。

圖2 SSCE作用24 h后Hochest33342染色倒置熒光顯微鏡觀察細胞核Fig.2 Immunofluorescence staining of Hochest33342 in SSCE incubated A549 cells(100×)

2.3 SSCE對細胞線粒體的影響

SSCE作用于A549細胞24 h后，紅色熒光向綠色熒光轉變，綠色熒光與紅色熒光比值升高，詳見表2，圖3。

正常細胞線粒體經染色后，呈均勻的棒狀、顆粒狀(圖4A);SSCE作用于細胞24 h后，線粒體由顆粒狀、棒狀變為點狀，并向細胞核聚集(圖4B)。

表2 不同劑量SSCE作用A549細胞24 h后線粒體膜電位的改變Tab.2 Effect of SSCE on the mitochondrial membrane potential of A549 cells(±s)n=4

表2 不同劑量SSCE作用A549細胞24 h后線粒體膜電位的改變Tab.2 Effect of SSCE on the mitochondrial membrane potential of A549 cells(±s)n=4

＊＊ P ＜0.01 vs control;SSCE:spatholobus suberectus column extract.

SSCE Green fluorescence/Red fluorescence Control 0.557 ±0.082 160 mg/L 3.057 ±0.365＊＊80 mg/L 2.426 ±0.440＊＊40 mg/L 1.954 ±0.451＊＊

圖3 SSCE作用24 h后JC-1染色激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位Fig.3 Immunofluorescence staining of JC-1 in SSCE incubated A549 cells(600×)

3 討論

雞血藤是一味養血活血中藥，中醫古籍記載用于治療月經不調、血虛萎黃、風濕痹痛等癥，藥化分析發現其含有大量黃酮類化合物。現代藥理學研究［3］證實雞血藤具有刺激骨髓造血功效，近年來研究［3］發現雞血藤粗提物及其總黃酮組分在細胞水平和整體的動物水平都表現出抗腫瘤活性，其中富含黃酮成分的有效部位SSCE在體外抑瘤作用最強。

人們一直以為細胞增生和分化的異常是腫瘤發生的主要原因，隨著對細胞凋亡概念的引入，人們開始從細胞凋亡的角度審視腫瘤的發生［4］。細胞凋亡是細胞對內外刺激信號做出的應答反應，在機體的許多生理、病理過程中都起到重要的作用。

圖4 SSCE作用24 h后Mitotracker red染色激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態Fig.4 Immunofluorescence staining of Mitotracker red in SSCE incubated A549 cells(600×)

線粒體不僅在細胞存活而且在細胞凋亡通路中起著核心作用。細胞凋亡過程中，線粒體形態和功能均發生顯著變化。線粒體跨膜電位的下降或線粒體膜通透性轉運孔開放是調節細胞凋亡的中心環節。在致凋亡因子的刺激下，線粒體膜通透性轉運孔開放，線粒體跨膜電位降低或喪失，線粒體基質中釋放出凋亡蛋白使細胞凋亡。劉麗啟等［5］報道線粒體跨膜電位的耗散是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的時間，而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

本研究前期實驗通過流式細胞儀對PS及細胞周期進行了檢測，發現SSCE可以使細胞周期S期細胞增多，G0-G1和G2-M期細胞減少。本研究結果進一步證實，SSCE作用于細胞24 h后，PS表現外翻、細胞質固縮，線粒體由棒狀變成點狀，并向細胞核聚集，線粒體膜電位顯著下降，有明顯的凋亡特征;提示SSCE可能對線粒體凋亡通路發揮作用。

凋亡通路包括線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑，隨著細胞生物學研究的深入，新的細胞死亡途徑逐漸被揭示出來，如脹亡、自噬、副凋亡等［6］。在細胞程序性死亡過程中，各種通路不是單獨起作用的，而是相互交聯的，有彼此重疊的機制出現。因此，SSCE誘導A549細胞凋亡的機制仍需進一步研究。

［1］唐勇，王笑民，何薇，等.雞血藤提取物體外抗腫瘤實驗研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2007，13(4):306-308.

［2］薛麗君，韓景光，李定文.雞血藤提取物的抗腫瘤作用研究［J］.現代醫藥衛生，2009，25(1):3-5.

［3］富琦，唐勇，羅曉琴，等.雞血藤SSCE體內抗腫瘤作用及機制研究［J］.中國中藥雜志，2009，34(12):1570-1573.

［4］湯睿，朱正綱.凋亡途徑與腫瘤治療［J］.世界華人消化雜志，2005，13(20):2469-2472.

［5］劉麗君，彭建新，洪華珠，等.線粒體在細胞凋亡中的變化與作用［J］.細胞生物學雜志，2005，27(2):117-120.

［6］敏云馨，馬忠仁.細胞程序性死亡通路的研究進展［J］.生物技術報，2009，11:20-23.