點擊化學反應原位制備海藻酸鈉水凝膠

張 橋, 鄢國平，程巳雪

(1．武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北 武漢 430074；2．武漢大學化學與分子科學學院生物醫(yī)用高分子材料教育部重點實驗室，湖北 武漢 430072)

0 引 言

海藻酸鈉(alginate)是一種天然多糖，具有很好的生物相容性，被廣泛用于食品和醫(yī)用領域.海藻酸是由古洛糖醛酸(G單元)和甘露糖醛酸(M單元)兩種結構單元組成的線性嵌段共聚物，其中G單元可以與鈣、銅、鋅等二價離子螯合，在溫和的條件下迅速形成水凝膠.由于形成的水凝膠無毒無害，被廣泛應用于藥物載體、組織工程支架、細胞微膠囊化等領域[1-2].但是離子交聯(lián)的海藻酸鈉水凝膠放置一段時間后機械強度會逐漸下降，這可能是因為交聯(lián)的離子會擴散到周圍的溶液中，從而使水凝膠的交聯(lián)密度下降.用雙功能團的交聯(lián)劑共價交聯(lián)海藻酸鈉可以得到更為穩(wěn)定海藻酸鈉水凝膠[3].例如先用高碘酸鈉氧化海藻酸鈉，然后用己二酸二酰肼交聯(lián)，可得到機械強度較高的水凝膠[4].但是用普通化學交聯(lián)需要在較苛刻的條件下反應，并可能引入有害的催化劑，降低海藻酸鈉水凝膠的生物相容性.

點擊化學是一類選擇性高、反應速率快、產(chǎn)率高的化學反應.由于它反應條件溫和，基本沒有副產(chǎn)物，已經(jīng)廣泛用于藥物開發(fā)和生物醫(yī)用高分子材料的制備[5-7].用點擊化學制備的高分子材料具有較好的強度和生物相容性.有研究報道，細胞可以在用“點擊”化學制備的透明質酸水凝膠內(nèi)生長[8].本研究合成了疊氮化和炔基化的海藻酸鈉，再利用疊氮基和炔基之間的環(huán)加成點擊化學反應制備海藻酸鈉水凝膠，該水凝膠具有較大的孔徑和pH敏感性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉(Mw=2.85×105)購自國藥集團，丙炔胺購自Sigma，乙醇胺使用前減壓蒸餾.N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自國藥集團, 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)購自上海寶曼生物試劑有限公司, 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖鹽購自Amresco, 其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 海藻酸鈉水凝膠的制備

1.2.1 疊氮基和炔基海藻酸鈉的合成 在10 ℃ 將30.5 g 40% 溴化氫緩慢滴加到6.1 g乙醇胺中，滴加完成后10 ℃ 反應1 h,繼續(xù)滴加30.5 g 40% 溴化氫之后,加入35 mL二甲苯，升溫回流，同時用分水器分水，減壓蒸餾二甲苯，冷卻，再用丙酮洗滌二次，得產(chǎn)物2-溴代乙胺溴酸鹽17.28 g，收率 84.3%.

將3.9 g疊氮化鈉溶于20 mL蒸餾水中，再加入4.1 g 2-溴代乙胺溴酸鹽，在 75 ℃反應21 h后，冷卻到0 ℃，加入20 mL乙醚和4 g氫氧化鉀，分離有機相，水相用100 mL乙醚萃取3次，合并有機相，用無水硫酸鎂干燥過夜后，過濾，旋蒸去除乙醚得產(chǎn)物2-疊氮乙胺0.838 3 g,收率48.7%.

將0.515 g海藻酸鈉溶于25 mL MES緩沖液中(50 mM, pH=4). 加入0.288 g，EDC·HCl和0.173 g NHS,活化海藻酸鈉上羧基，再加入346 μL 2-疊氮乙胺或166 μL丙炔胺室溫反應24 h后，用透析袋(截留分子量8 000～12 000)透析5 d，最后將溶液凍干得到疊氮基海藻酸鈉(Alg-N)和炔基海藻酸鈉(Alg-C).

1.2.2 海藻酸鈉水凝膠的制備 稱取60 mg Alg-N和60 mg Alg-C溶于2.4 mL蒸餾水，再加入1 mL 1%(w/v)的氯化亞銅溶液，劇烈攪拌，幾分鐘后即可到穩(wěn)定的海藻酸鈉水凝膠Alg-Gel.水凝膠用10 mM的EDTA溶液透析12 h, 再用蒸餾水透析24 h.

1.3 海藻酸鈉水凝膠的表征

將干燥的海藻酸鈉、疊氮基海藻酸鈉、炔基海藻酸鈉和海藻酸鈉水凝膠磨碎后，用KBr壓片，由Perkins Elmer-2紅外分光光度計測定其紅外光譜圖.

在水凝膠達到吸水平衡后凍干，凍干后的截面形貌由SEM(Hitachi X650，Japan)觀測.

1.4 水凝膠溶脹比的測定

精確稱取一定量的干凝膠(W0)放入小燒杯中，浸入不同的pH緩沖溶液中，達到溶脹平衡后取出，用濾紙拭去表面吸附的水后，準確稱取濕凝膠的質量(W1)，按下式計算水凝膠的溶脹比(S).

S=(W1-W0)/W0×100%

2 結果與討論

2.1 水凝膠的制備與表征

本研究利用乙醇胺通過溴化反應、疊氮化反應合成了2-疊氮乙胺，再利用EDC·HCl和NHS將2-疊氮乙胺和丙炔胺分別與海藻酸鈉縮合，得到疊氮基海藻酸鈉和炔基海藻酸鈉，最后用一價銅催化的疊氮基和炔基的環(huán)加成反應制備海藻酸鈉水凝膠.在疊氮化海藻酸鈉和炔基化海藻酸鈉的混合水溶液中加入氯化亞銅水溶液，激烈攪拌靜置幾分鐘后可得到穩(wěn)定的水凝膠，得到的水凝膠需要用EDTA和純水透析，去除亞銅離子.與其它通過化學交聯(lián)制備海藻酸鈉水凝膠的方法相比，本方法反應條件溫和、簡單方便.

由于炔基和疊氮基都是特殊功能基團，利用紅外圖譜可以表征疊氮化海藻酸鈉和炔基化海藻酸鈉的結構[9].如圖2所示，Alg-C的紅外光譜圖含有2 095 cm-1炔基特征峰，Alg-N的紅外光譜圖含有2 109 cm-1疊氮基特征峰，說明通過氨基和羧基的縮合反應可以分別將炔基和疊氮基引入海藻酸鈉中.Alg-Gel紅外圖譜中2 095 cm-1處炔基特征峰消失，2 109 cm-1疊氮基特征峰顯著減小，說明炔基化海藻酸鈉和疊氮化海藻酸鈉之間發(fā)生了點擊化學反應,生成了化學交聯(lián)的海藻酸鈉凝膠.

圖3是水凝膠達到吸水平衡后經(jīng)冷凍干燥后的截面電鏡圖，用點擊化學制備的海藻酸鈉水凝膠具有與普通水凝膠相同的多孔網(wǎng)狀結構，但孔徑較大，平均孔徑大約為60 μm. 通常在制備大孔徑的水凝膠時，需要加入致孔劑，例如PEG[10]. 致孔劑通過空間位阻效應產(chǎn)生較大孔徑.本研究獲得的大孔徑水凝膠可能是含炔基和疊氮基的側鏈提供了相類似的空間位阻.另外，水凝膠較大的孔徑也可能是凝膠交聯(lián)密度較低所致.

圖1 點擊化學制備海藻酸鈉凝膠的路線

圖2 海藻酸鈉、海藻酸衍生物和海藻酸凝膠的紅外光譜圖

圖3 點擊化學制備的海藻酸鈉水凝膠的SEM圖

2.2 水凝膠溶脹行為分析

圖4 pH值對海藻酸鈉水凝膠溶脹率的影響

通常如果水凝膠含有弱酸性或弱堿性基團都會有一定的pH敏感性.用“點擊”化學合成的海藻酸鈉水凝膠含有羧酸根.其在一定pH范圍內(nèi)可以轉化為羧基，從而影響水凝膠的溶脹率.由圖3顯示出本方法合成的海藻酸鈉水凝膠具有pH敏感性.在溶脹過程中pH值較高時，水凝膠中網(wǎng)鏈上的羧酸根帶負電，由于靜電的相互排斥作用，使得水凝膠網(wǎng)絡擴張，從而溶脹率較高.而隨著pH 值的降低，水凝膠中的羧酸根轉化為羧酸，凝膠網(wǎng)絡中的靜電作用消失，所以溶脹率較低.

3 結 語

本研究合成了炔基和疊氮基海藻酸鈉，并首次用炔基和疊氮基之間的點擊化學反應制備了海藻酸鈉水凝膠.由于在水凝膠的制備過程中炔基和疊氮基側鏈的空間位阻效應使得制備的水凝膠具有較大的孔徑.此外，水凝膠具有pH敏感性.本方法較其它化學交聯(lián)海藻酸鈉制備水凝膠的方法快速方便，反應條件溫和.有望成為藥物控制釋放的載體材料.

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