噬菌體作指標病毒用于消毒效果評價的研究

張亮明 翁麗娟 陳少素

（深圳市龍崗區平湖人民醫院，廣東 深圳 518111）

指示病毒指的是一種在消毒滅菌實驗中用以減少危險性和傳染性、培養容易的病毒類型，其對消毒滅菌的實驗效果有一定的評價作用[1]。噬菌體是由Twort和D. Herelle發現的，定義為真菌、感染細菌、螺旋體等微生物的合稱[2]。為研究臨床使用噬菌體作為指示病毒對于消毒滅菌的效果評價，筆者選取大腸桿菌T7噬菌體作為指標病毒，進行三氯異氰尿酸滅活實踐，報道如下。

1 資料與方法

1.1 消毒液置備

分別置備有效氯濃度為150（A）、150（B）、200（C）、250（D）mg/L的三氯異氰尿酸溶液各4mL，并將其分A、B、C、D四組備用。

1.2 懸液置備

取2mg/L的氯化鈣溶液和1000mg/L的葡萄糖溶液混合，制備營養培養基。將20mL培養基置入三角燒瓶，臨床取宿主菌新鮮幼齡大腸桿菌進行純化分離后接種入培養基。將燒并放在150r/min、37℃的環境中振蕩培養，約4～5h后取出。將自中科院武漢病毒研究所的T7噬菌體懸液（感染系數為10～50）滴入燒瓶，再繼續振蕩培養約2h。將懸液進行8000r/min的離心操作，約15min，后取上清液，采用雙層瓊脂噬斑定量法進行計數，備用。

1.3 試驗方法

在無菌條件下，將已配置好的噬菌體懸液取出分別置入4個燒杯中，A1燒杯0.5mL，B1、C1、D1燒杯各1mL。將A1燒杯中的噬菌體懸液與0.5mL濃度為30g/L小牛血清白蛋白溶液混勻，置于20℃恒溫箱中5分鐘后取出，加入4mL濃度為150mg/L的三氯異氰尿酸溶液，混合均勻；B1、C1、D1燒杯中分別倒入濃度為150（A）、200（B）、250（C）mg/L三氯異氰尿酸消毒溶液。四個燒杯均放置約10～15min，待溶液混合均勻后，分別取出0.5mL混合液至四個4.5mL的中和劑試管中（A2、B2、C2、D2），作用10min取0.5mL樣液進行雙層瓊脂法噬斑計數。后取B2中剩余混合液，分成3份，分別置于10℃（E）、20℃（F）、30℃（G）環境下10分鐘，取出測定噬斑量。

1.4 觀察指標

通過實驗結果計算滅活率（%），分別計為A3、B3、C3、D3、E、F、G，比較分析。

1.5 統計學處理

采用SPSS11.0統計學分析軟件包，計數資料采用卡方檢驗，當P＜0.05時，認為具有統計學意義。

表1 不同濃度消毒液滅活率比較（%）

2 結 果

表2 不同溫度條件下滅活率比較（%）

由表1，B3、C3、D3隨著消毒液濃度的增加，滅活率增大，C3、D3分別與B3比較具有顯著差異（χ2=5.96、7.28，P＜0.05），C3、D3比較無顯著差異（χ2=2.59，P＞0.05）；150mg/L消毒液加小牛上清液的滅活率為98.574%，明顯低于B3，數據經統計學分析具有顯著差異（χ2=7.39，P＜0.05）。

由表2，不同溫度條件下滅活率不同，10℃滅活率99.794%明顯低于20℃滅活率99.995%（χ2=9.78，P＜0.05），30℃滅活率99.665%明顯低于20℃滅活率99.995%（χ2=8.56，P＜0.05）。

3 討 論

三氯異氰尿酸屬于有要類含氯化合物，具有較明顯的殺菌活性，常被臨床應用[3,4]，其對T7噬菌體也有較好的殺滅作用。有研究表明噬菌體的選擇應具有可操作性、安全性、穩定性、易培養等特點，大腸桿菌T7噬菌體屬于感染大腸桿菌的一種烈性噬菌體，是短尾噬菌體科中具有代表性的病毒株，其無包膜、雙鏈線型DNA、易繁殖、性質穩定、且在惡劣環境下也不易遭到破壞[5-7]，因而本組研究選用了該噬菌體作為指示病毒，以期獲得更加科學的研究結果。

在諸多消毒相關的文獻研究中我們發現，多種因素可能影響到消毒效果，包括消毒液濃度、消毒時間、混合物、溫度條件等[8]，本組研究主要以消毒液濃度和溫度條件為研究指標進行探討。通常情況下，消毒劑濃度越高，其殺滅效果越好，這在本組研究中得到證實，隨著三氯異氰尿酸從150mg/L一直增長到250mg/L，同等環境和操作條件下的滅活率逐漸升高，C3、D3分別與B3比較具有顯著差異，C3、D3比較無顯著差異，分析當消毒液濃度達200-250mg/L之間的某一濃度時，滅活率即可達到100%，因而C3與D3的滅活效果相差無幾。但是加入小牛上清液的A3組滅活率明顯下降，分析為有機物起到了保護作用。有機物能夠在病毒表面形成一層保護膜，這使消毒溶液難以直接接觸病毒，使噬菌體無法被殺滅。因而筆者建議在存在有機物干擾的環境下，可考慮適當加大消毒液濃度以期獲得更好的殺菌效果。

一般規律認為，隨著溫度的升高，消毒液的殺菌活性增大，會產生更強的滅菌效果。但在本組研究中我們發現，溫度從10℃上升為20℃時，滅活率明顯增加，但溫度從20℃上升至30℃時，滅活率反而下降。筆者分析這可能由于氯本身屬于易揮發元素，當溫度提升時，使三氯異氰酸溶液中存在的有效氯濃度降低，從而影響了消毒液的殺菌效果。

總之通過本組研究我們發現，噬菌體是評價三氯異氰酸消毒效果的較好指示病毒，且消毒液濃度越高，其消毒效果越佳，但高溫可能通過降低消毒液的濃度而影響消毒效果。

[1] 陳昭斌,張朝武.消毒效果評價中指示病毒的應用[J].中國消毒學雜志,2008,25(5):528-530.

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[5] 陳昭斌,張朝武.MS2噬菌體在消毒學應用研究中的進展[J].中國消毒學雜志,2008,25(2):181-183.

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