欖香烯對人肝癌HepG-2細胞增殖及拓撲異構酶表達的影響

龔 敏，梁鑫淼，崔曉楠

(1.大連醫科大學附屬第一醫院腫瘤科，遼寧 大連 116011;2.中科院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023)

目前化療藥物對肝癌有效率不超過20%［1］。靶向藥物，如sorofenib、erlotinib等未能改變肝癌治療現狀［2］。因而探索高效低毒的抗肝癌藥物歷來是醫學關注的熱點。欖香烯(elemene，ELE)是從活血化瘀中藥姜科植物溫莪術中提取出的抗癌活性單體，研究表明 ELE對多種腫瘤具有抑制作用［3－5］，表現出高效低毒的中藥特質，尤其對肝癌顯示出良好臨床療效［7］。然而，其機制有待深入研究。TOPOⅠ、TOPOⅡ是調節核酸拓撲構型的關鍵酶，已成為抗癌藥物研究的重要靶點之一［9］，目前關于ELE對TOPOⅠ、TOPOⅡ的作用機制未見報道。本研究觀察了ELE對人肝癌HepG-2細胞增殖、細胞凋亡及TOPOⅠ、TOPOⅡ表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細胞株HepG-2(大連醫科大學附屬第一醫院中心實驗室傳代、保存);ELE(大連金港制藥有限公司，批號0508031);MTT(Biosharp公司);AnnexinV試劑盒(美國Molecular Probes公司);RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);PCR擴增引物(由大連寶生物工程有限公司合成);碘化丙啶(Sigma公司);溴化乙錠(Amresco公司);TRIzol試劑盒(Invitrogen公司);氯仿、異丙醇、乙醇(均為國產分析純);十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺(美國Sigma公司);甘氨酸(上海生工生物工程技術有限公司);1 mol·L－1Tris(pH 6.8)、1.5 mol·L－1Tris(pH 8.8)和超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所);蛋白質定量試劑盒(BCA法)(凱基生物有限公司);兔抗人TOPOⅠ多克隆抗體(sc-10783)，兔抗人TOPOⅡ多克隆抗體(sc-13059)(Santa Cruz公司);辣根酶標記山羊抗兔IgGⅡ抗(河北博海生物工程有限公司)。

1.2細胞培養將HepG-2細胞接種于含10%新生牛血清的低糖IMDM培養基中。孵箱的培養環境為5%CO2，37℃，飽和濕度。每兩天更換1次培養基，細胞長至鋪滿瓶底約90%，用質量濃度為2.5 g·L－1胰蛋白酶消化傳代培養。

1.3細胞形態學觀察設對照組和ELE(20、40、60、80、100 mg·L－1)濃度組。細胞接種在 6 孔板上，作用72 h后，倒置光學顯微鏡下觀察HepG-2細胞形態變化。實驗重復3次。

1.4MTT法檢測腫瘤細胞增殖96孔板中每孔接種5 000個細胞100 μl。分對照組、藥物 ELE(20、40、60、80、100、120、140、160、180 及 200 mg·L－1)10個濃度組，培養時間分別24、48、72 h，每組8個復孔，于37℃，5%CO2條件下培養，各時間點進行MTT 試驗，每孔加入 MTT 液(5 g·L－1)20 μl，繼續培養4 h，小心吸去培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩 6 min，用酶標儀 570 nm 波長測定各孔吸光度(A)，根據A值計算抑制率。抑制率(IR)/%=(1－試驗組A值/對照組A值)×100%。以藥物濃度為橫軸，細胞抑制率為縱軸，根據量效曲線計算半數抑制濃度(IC50值)。實驗重復3次。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數生長期細胞按5×108個·L－1濃度接種于25 cm2培養瓶內，設立對照組和實驗組(ELE濃度為20、40、60 mg·L－1)，分別作用24、48 h收集細胞，用預冷的PBS洗2遍，1×Binding buffer調整細胞至1 ×109·L－1余按試劑盒說明書操作，在流式細胞儀(FCM)上對細胞凋亡及死亡進行熒光檢測和分析。實驗重復3次。

1.6 RT-PCR檢測TOPOⅠ、TOPOⅡmRNA表達取對數生長期細胞調濃度至5×108·L－1接種于25 cm2培養瓶內，設立對照組和實驗組(ELE濃度為20、40、60 mg·L－1)，培養 48 h 后收集各組細胞。用TRIzol提取細胞總RNA。RT-PCR步驟按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進行，將RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR反應，β-actin為內參照。β-actin引物大小為404 bp，上游引物5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3';下游引物:5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。TopoⅠ引物大小為565 bp:上游引物:5'-CGCTATCCTGAAGGCATCAA-3';下游引物:5'-CTGGAGGAGGAGAAGGAACC-3'。TopoⅡ引物大小為233 bp:上游引物:5'-CTTGTACTGCAGACCCACA-3';下游引物:5'-ATAATAGAATCAAGGGAATTCCCAAGTC-3'。將PCR產物在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓控制在90 V，UVP凝膠成像及分析系統觀察、拍照、分析。實驗重復3次。

1.7Western blot檢測TOPOⅠ、TOPO II蛋白的表達取對數生長期細胞調濃度至5×108·L－1接種于25 cm2培養瓶內，設立對照組和實驗組(ELE濃度為20、40、60 mg·L－1)，培養 48 h 后，吸掉培養液，用預冷PBS沖洗3次，RIPA裂解液裂解細胞提取細胞內蛋白，BCA法進行蛋白質定量，用8%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，轉PVDF膜。封閉液室溫封閉1 h，按適當比例加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，按1∶3 000的稀釋倍數加入辣根酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，用ECL顯色并曝光于X膠片。將底片掃描，并用Image J軟件的圖像分析儀分析。實驗重復3次。

1.8統計學方法數據以ˉx+s表示，采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。數據分析采用單因素方差檢驗。

2 結果

2.1ELE對人肝癌HepG-2細胞生長抑制形態學觀察在倒置光學顯微鏡下，觀察到ElE在體外可以明顯抑制人肝癌HepG-2細胞的生長。培養72 h后對照組細胞為貼壁的梭形細胞，細胞排列緊密。而加入不同濃度的ELE干預的HepG-2細胞，隨著濃度增加，細胞體積逐級縮小，胞膜皺折，核漿比例減小，核邊聚伴有碎裂，原來堆積成團的HepG-2細胞結合力下降，松散成個體漂浮，散在分布。視野內可見細胞崩解碎片增多(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ELE on cell morphology of human hepatocellular carcinoma HepG-2(×40)

2.2MTT法檢測腫瘤細胞生長狀態隨著藥物濃度增加，細胞增殖能力逐漸下降，表現為時間和劑量依賴性;藥物作用24、48和72 h后，IC50值分別為96.13、80.84、60.95 mg·L－1(Fig 2)。

Fig 2 Inhibitory effect of ELE on proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells

2.3ElE對人肝癌HepG-2細胞凋亡的作用不同濃度的ELE分別作用于HepG-2細胞24、48 h，應用AnnexinV和PI染色后，FCM分析細胞凋亡。結果表明，與對照組相比，藥物組凋亡細胞比例增高，表現為時間和劑量依賴性(Tab 1，Fig 3)。

Tab 1 ELE dose-dependent apoptosis rate(48 h，% ，±s，n=3)

Tab 1 ELE dose-dependent apoptosis rate(48 h，% ，±s，n=3)

ELE concentrations Late apoptosis Early apoptosis Total apoptotic ratio Necrotic ratio Negative control 0.49 ±0.17 0.58 ±0.19 1.07 ±0.35 0.44 ±0.18 60 mg·L －1 14.03 ±1.08 20.36 ±1.92 34.38 ±2.61 8.38 ±1.27 40 mg·L －1 12.23 ±0.52 14.91 ±1.38 27.14 ±0.87 6.63 ±0.78 20 mg·L －16.24 ±0.88 8.45 ±1.15 14.69 ±1.77 3.23 ±0.82

Fig 3 Effect of ELE on apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells

2.4 ELE對人肝癌HepG-2細胞TOPOⅠ和TOPOⅡmRNA表達的影響ELE作用48 h后TOPOI mRNA、TOPOⅡmRNA的表達隨藥物濃度的升高表達降低。實驗組(ELE濃度分別為20、40、60 mg·L－1)，TOPOⅠmRNA 與 β-actin mRNA 光密度比值(0.84±0.08、0.68±0.01、0.58±0.04)明顯低于對照組(1.10±0.06)(P＜0.05);TOPOⅡmRNA與β-actin mRNA光密度比值(0.93±0.03、0.71±0.03、0.57±0.02)明顯低于對照組(1.18±0.03)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ、TOPOⅡ轉錄，并呈劑量依賴性(Fig 4)。

2.5Western blot檢測結果隨著給藥物組ELE濃度的增高，TOPOⅠ蛋白，TOPOⅡ蛋白表達降低。20、40、60 mg·L－1濃度的 ELE 作用人肝癌 HepG-2細胞48 h后，TOPOⅠ蛋白與β-actin蛋白條帶的光密度比值為(0.960±0.036、0.759±0.034、0.591±0.049)明顯低于對照組(1.161±0.043)(P＜0.05);TOPOⅡ蛋白與β-actin蛋白條帶的光密度比值(0.937±0.029、0.752±0.015、0.600±0.017)明顯低于對照組(1.134±0.045)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ蛋白，TOPOⅡ蛋白表達，并呈劑量依賴性(Fig 5)。

3 討論

從天然藥物中篩選高效低毒的抗腫瘤藥物是獲取抗腫瘤藥物的基本策略。ELE是祖國傳統中藥溫莪術中提取的抗癌單體，臨床抗腫瘤療效評價良好，尤其對化療非敏感腫瘤肝癌表現出抑癌效果［5－7］。基礎研究表明ELE能夠促進腫瘤細胞凋亡［8］，誘導細胞周期阻滯，干擾信號傳導通路，抑制腫瘤轉移等多靶位抗腫瘤作用。然而有關ELE對TOPO酶的作用未見報道。

拓撲異構酶(TOPO)是一種通過調節核酸空間動態變化從而控制核酸生理功能的關鍵酶，分為TOPOI型和TOPOⅡ型兩種類型，通過干擾TOPOⅠ和(或)TOPOⅡ誘導細胞凋亡是目前抗癌藥物的重要作用機制［9］。一線抗腫瘤藥物羥基喜樹堿、拓撲替康和伊立替康是以TOPOⅠ為靶位;依托泊苷和替尼泊苷是以TOPOⅡ為靶位實現誘導腫瘤細胞凋亡的藥效機制。在本實驗中，我們發現ELE能夠抑制人肝癌HepG-2細胞增殖，誘導其凋亡，呈時間與劑量依賴性。誘導凋亡是藥物實現腫瘤殺傷的重要途徑，抗腫瘤藥物通過不同的機制誘導了細胞凋亡過程。有別于經典的抗肝癌藥物，如一線抗肝癌藥物順鉑通過在大分子水平上直接破壞DNA的雙鏈;氟尿嘧啶通過在小分子水平上阻斷DNA的合成，進而啟動腫瘤細胞凋亡程序，我們的實驗表明ELE能夠下調TOPOⅠ、TOPOⅡmRNA和蛋白的表達。因此，提示ELE抑制人肝癌HepG-2細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，可能是通過下調TOPOⅠ、TOPOⅡ表達，從而實現藥效機制。研究表明ELE能夠影響肝癌細胞凋亡相關基因、熱休克蛋白及其相關調控因子基因的表達，抑制肝癌細胞遷移、侵襲等［10－13］，表現為多靶位的抗肝癌作用，然而，有關ELE對TOPO酶的影響未見報道。我們的研究首次表明干擾TOPOⅠ、TOPOⅡ表達可能為ELE抑制肝癌的作用靶位，ELE是值得關注的抗肝癌藥物。

Fig 4 TOPOⅠmRNA and TOPOⅡmRNA expressions of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

Fig 5 TOPOⅠprotein and TOPOⅡprotein expressions of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

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