格列本脲對GK大鼠心肌的保護(hù)作用實驗研究

郭秋平，肖百全，楊 威，雷夏凌，黃遠(yuǎn)鏗，張寒冰

(廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院藥物非臨床評價研究中心，廣東廣州 510240)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)指由糖尿病引起心臟微血管病變、心肌代謝紊亂和心肌纖維化等所致的心肌廣泛結(jié)構(gòu)異常的一種疾病狀態(tài)［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素(Ang-Ⅱ)增多、游離脂肪酸(IFFA)在DCM的發(fā)病中起著重要的作用。

格列本脲為目前臨床上常用的磺酰脲類口服降糖藥，其對DCM的影響報道較少。本研究從電鏡及特殊染色等方面觀察了格列本脲對GK大鼠心肌的影響，并從Ang-Ⅱ及IFFA等方面，對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1動物分組及處理GK大鼠、Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量220～350 g，上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2007-0005。GK大鼠分為模型組、格列本脲 A、B(2.8、1.4 mg·kg－1)組，正常組選用 Wistar大鼠。每天給藥1次，連續(xù)12周，末次給藥后4 h測定各組大鼠血糖，進(jìn)行心肌組織電鏡檢查，并采用PAS、Masson 3色染色觀察心肌糖原及膠原纖維的變化，檢測血清IFFA及心肌組織Ang-Ⅱ。

1.2藥物及主要試劑格列本脲片，天津藥物研究所，批號080715。GLUCOCARDⅡ型血糖試紙，ARKRAY Factory Inc，批號:9C5C4S。糖原染色試劑盒，廣州市儷科貿(mào)易有限公司，批號:20090815。游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。血管緊張素(Ang-Ⅱ)測定試劑盒:大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3主要儀器GT-1640血糖儀:ARKRAY Factory。Leica ASP 300全密封自動脫水機(jī)、EG1160石蠟包埋機(jī)，德國Leica。Microm HM400平推式切片機(jī)，德國MICROM。病理圖像分析系統(tǒng):日本OLYMPUS。ELX800:基因公司。

1.4方法

1.4.1血糖檢測給藥前、給藥12周后末次給藥后4 h，采用血糖儀測定每只動物的血糖。

1.4.2電鏡檢查大鼠麻醉，取左心室心肌，放入3%的戊二醛固定液，PBS漂洗，丙酮梯度脫水，Epon812包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡觀察。

1.4.3PAS染色［2］切片脫蠟至水，PAS染色。圖像分析儀測定心肌糖原含量。

1.4.4Masson 3色染色［3］切片脫蠟至水，Masson3 色染色。圖像分析儀測定心肌膠原含量。

1.4.5心肌組織Ang-Ⅱ檢測心肌細(xì)胞勻漿，取上清液按試劑盒操作，ELX800檢測。

1.4.6血清IFFA檢測大鼠腹主動脈采血，分離血清，按試劑盒操作，ELX800檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料的值用±s表示，組間均數(shù)比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1血糖檢查結(jié)果模型組GK大鼠給藥前及12周后血糖值穩(wěn)定，均高于正常組。格列本脲能降低GK大鼠血糖值，結(jié)果見Tab 1。

2.2電鏡檢查結(jié)果空白組:肌纖維排列整齊，Z線清晰;線粒體嵴發(fā)達(dá)，排列緊密;閏盤、細(xì)胞核、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)正常。模型組:肌纖維明顯減少，模糊、排列疏松，Z線模糊;線粒體聚集，嵴斷裂、消失或不發(fā)達(dá)，部分空化;閏盤欠規(guī)則;內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，基底膜較寬。格列本脲A組:肌纖維排列略顯疏松;個別線粒體嵴欠發(fā)達(dá)，輕微空化;閏盤清晰可見;毛細(xì)血管、內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。格列本脲B組:肌纖維基本排列緊密、整齊，局部略有疏松，Z線清晰;線粒體嵴發(fā)達(dá)，排列整齊;閏盤清晰可見，數(shù)目較少;毛細(xì)血管、內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。

2.3心肌糖原及膠原纖維測定結(jié)果模型組GK大鼠心肌組織糖原含量、膠原纖維含量高于正常組，格列本脲能減少GK大鼠心肌組織糖原及膠原纖維的含量，結(jié)果見Tab 2。

2.4IFFA、Ang-Ⅱ測定結(jié)果模型組GK大鼠血清IFFA、心肌組織Ang-Ⅱ含量高于正常組，格列本脲能減少GK大鼠血清IFFA及心肌組織Ang-Ⅱ含量，結(jié)果見Tab 3。

Tab 1 Effects of glibenclamide on blood glucose of GK rats(±s，n=8，mmol·L－1)

Tab 1 Effects of glibenclamide on blood glucose of GK rats(±s，n=8，mmol·L－1)

＊＊P ＜0.01 vs group normal;▲P ＜0.05 vs group model.

Group Dose/mg·kg－1before administration 12 wk Normal － 4.5 ±0.4 4.5 ±0.2 Model － 16.6 ±3.9＊＊ 16.2 ±3.2＊＊Glibenclamide A 2.8 16.9 ±3.7 11.9 ±4.3▲Glibenclamide B 1.4 16.5 ±2.9 14.5 ±4.6

Tab 2 Effects of glibenclamide on myocardium glycogen and collagen fiber of GK rats(±s，n=8，IOD)

Tab 2 Effects of glibenclamide on myocardium glycogen and collagen fiber of GK rats(±s，n=8，IOD)

＊＊P ＜0.01 vs group normal;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs group model.

Group Dose/mg·kg－1Glycogen Collagen fiber Normal － 254.3 ±7.7 428.7 ±19.4 Model － 9578.3 ±637.2＊＊ 1514.5 ±39.7＊＊Glibenclamide A 2.8 6446.0 ±1402.3▲ 838.7 ±147.7▲▲Glibenclamide B 1.4 7156.0 ±1812.6 893.2 ±92.9▲▲

Tab 3 Effects of glibenclamide on Ang-Ⅱand IFFA of GK Rats(±s，n=8，mg·L－1)

Tab 3 Effects of glibenclamide on Ang-Ⅱand IFFA of GK Rats(±s，n=8，mg·L－1)

＊＊P ＜0.01 vs group normal;▲P ＜0.05 vs group model.

Group Dose/mg·kg－1 Ang-ⅡIFFA Normal － 2.884 ±0.920 665.5 ±265.7 Model － 4.141 ±0.792＊＊ 1650.2 ±666.0＊＊Glibenclamide A 2.8 3.391 ±0.434▲ 990.6 ±414.4▲Glibenclamide B 1.4 3.643 ±1.140 1152.0 ±483.1

3 討論

GK大鼠是由Goto等1975年培育的自發(fā)性非肥胖性2型DM動物模型。具有胰島素分泌不足、β細(xì)胞數(shù)目減少，肝糖生成過多，肌肉和脂肪組織中度胰島素抵抗等典型2型DM特征，是研究2型DM較為理想的國際公認(rèn)的動物模型，Portha甚至認(rèn)為GK大鼠是研究2型DM最好的模型［4］，目前已廣泛應(yīng)用于2型DM及其并發(fā)癥包括DCM的研究。

磺脲類藥物的降糖機(jī)制是促進(jìn)胰島β細(xì)胞釋放胰島素。格列本脲是磺脲類降糖藥中降糖效果最強(qiáng)的，是目前治療2型糖尿病的主要藥物。目前，格列本脲對糖尿病心肌病的影響鮮有報道。

DCM患者心肌結(jié)構(gòu)紊亂，PAS陽性物質(zhì)沉積，心肌間質(zhì)膠原沉積。本次研究結(jié)果顯示，格列本脲能使GK大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)明顯改善，心肌糖原及膠原纖維含量減少，顯示了心肌保護(hù)作用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DM患者脂質(zhì)代謝異常，IFFA積聚，心肌鈣處理能力下降，心肌結(jié)構(gòu)和功能異常［5］。AngⅡ增多使心肌細(xì)胞總蛋白含量增多，心肌成纖維細(xì)胞增生，膠原沉積，從而造成心肌肥厚乃至纖維化［6］。DCM的發(fā)病還與心肌細(xì)胞的凋亡［7］及過氧化物增殖體激活受體［8］等有關(guān)。本次研究結(jié)果顯示，格列本脲能減少血清IFFA含量及心肌AngⅡ的含量，推測其心肌保護(hù)作用與IFFA及AngⅡ有關(guān)，在今后的研究工作中將對深入的機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

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