基于藥代動力學法評價補骨脂提取工藝的研究

霍仕霞，凱賽爾·阿不都克熱木，高 莉，彭曉明，王宇卿，閆 明

(1.新疆維吾爾醫藥研究所，新疆烏魯木齊 830049;2.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000)

中藥藥代動力學一直是新藥研究的熱點，以往對中藥有效成分研究，單純地從含量及藥效去評價一個工藝的好壞，而忽略了藥物在體內吸收、分布的特點。本研究以治療白癜風的中藥補骨脂為研究對象，經過不同工藝處理，得到補骨脂常規粉末、超微粉末、半仿生提取物、水提取物，進行了主要活性成分補骨脂素、異補骨脂素在大鼠體內的藥代動力學研究，建立了補骨脂素、異補骨脂素血藥濃度的HPLC分析方法，分別闡明了補骨脂不同工藝產物在大鼠體內的代謝過程，比較藥代動力學參數，以期揭示補骨脂藥效成分在大鼠體內的變化規律，從藥代動力學特征比較不同工藝的主成分吸收程度，優選最佳的工藝，為臨床前研究提供參考，尋求一種科學簡便的新的工藝評價方法。

1 實驗材料

DHQ-A型多用混合器(江蘇泰縣醫療器械廠)，TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠)，BP211D十萬分之一電子天平(Sartorius)，超純水儀，Shimadzu LC-10AD VP泵，Shimadzu SPD-M10A VP二極管陣列檢測器，Shimadzu CTO-10A VP柱溫箱，Shimadzu CLASS VP 6.2S色譜工作站。補骨脂藥材(華康藥業提供，產地四川)，補骨脂素、異補骨脂素對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為(1107397-200310;0738-200108)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。健康Wistar大鼠，♂，體質量(200±30)g，新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXY(新)2003-0001。

2 方法與結果

2.1補骨脂不同工藝產物制備

2.1.1常規粉末稱取干燥至恒重的140目補骨脂常規粉5.000 g，置25 ml量瓶中，邊攪拌邊加水，強力振搖，得0.2 g·ml－1(生藥)的補骨脂常規粉混懸液，含補骨脂素0.0191 g，異補骨脂素0.0164 g。

2.1.2超微粉末稱取干燥至恒重的300目補骨脂超微粉5.000 g，制備方法同上，得補骨脂超微粉混懸液，含補骨脂素0.0175 g，異補骨脂素0.0148 g。

2.1.3半仿生提取物稱取干燥至恒重的補骨脂半仿生提取物［1］干浸膏粉1.700 g，制備方法同上，得補骨脂半仿生提取物混懸液，含補骨脂素0.0236 mg，異補骨脂素0.0160 mg。2.1.4水提物稱取干燥至恒重的補骨脂半仿生提取物干浸膏粉1.615 g，制備方法同上，得補骨脂水提物混懸液，含補骨脂素0.0215 mg，異補骨脂素0.0148 mg。

2.2血漿樣品的制備

2.2.1動物分組及準備取健康wistar大鼠24只(♀♂各半)，隨機分組，每組6只，編號記錄體質量。分別為補骨脂常規粉末組、超微粉組、半仿生提取物組、水提物組。

2.2.2灌胃給藥及血漿收集給藥前禁食12 h，自由飲水。大鼠稱重，按3g·kg－1(生藥)給對應組大鼠灌胃相應的藥液。分別在給藥前及給藥后 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、14、24 h于大鼠尾靜脈采血，低速離心，分離血漿。取各組各時間點血漿100 μl為待測樣品，置－20℃冰箱中冷凍備用［2］。

2.2.3血漿樣品處理取待測血漿樣品分別加入對照品溶液 200 μl，內標溶液 100 μl，渦漩混勻 10 min，高速離心(1 500 r·min－1)10 min，沉淀血漿中蛋白，取上清液即得血漿樣品供試液［3］。

2.3色譜條件及標準溶液的制備色譜條件見參考文獻［1］。

2.3.1標準品溶液制備精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品4.26 mg、4.30 mg，分別置于10 ml棕量瓶中加甲醇溶解稀釋至刻度冷藏備用。

Tab 1 The pharmacokinetic parameters of psoralcn and isopsoralcn of different technics

2.3.2內標溶液的制備精密稱取7-甲氧基香豆素對照品1.46 mg置于100 ml棕量瓶中，加甲醇溶解定容。

2.4標準曲線的制備取3項下補骨脂素、異補骨脂素對照品溶液，逐級稀釋得補骨脂素、異補骨脂素混合標準系列溶液。取空白血漿8份，每份100 μl，分別加入上述對照品溶液200 μl，內標溶液 100 μl，按血樣處理方法處理血漿樣品，取上清液進樣20 μl。按照選定的色譜條件分析，記錄色譜圖，分別計算補骨脂素、異補骨脂素與內標物質的峰面積比值Y。建立回歸方程，得:補骨脂素:^Y1=1.898C－0.0598，r=0.9996;線性范圍:0.0341 ～1.7040 mg·L－1;異補骨脂素:^Y2=1.509C－0.0546，r=0.9995;線性范圍:0.0344 ～1.7200 mg·L－1。

2.5方法回收率與精密度［4］取空白血漿100 μl，分別加入200 μl混合標準溶液制備高、中、低3個不同濃度質控樣品(所加入的標液濃度分別為，補骨脂素:4.26、0.852、0.1704 mg·L－1，異補骨脂素:4.30、0.86、0.172 mg·L－1)。每個濃度各6份，分別取各樣品上清液20 μl進樣測定。計算得補骨脂素平均方法回收率分別為104.94%、97.88%、99.30%，異補骨脂素分別為107.68%、94.38%、99.13%;測得3種濃度標準血漿補骨脂素的日內RSD分別為1.51%、1.03%、0.50%(n=6)，日間 RSD分別為2.75%、2.26%、1.20%(n=6);異補骨脂素的日內 RSD分別為1.24%、1.17%、0.63%(n=6)，日間 RSD分別為3.97%、2.50%、1.55%(n=6)，表明該方法的準確度與精密度良好。

2.6血樣的分析測定及藥動學參數計算取各給藥組各時間點含藥血漿樣品100 μl，按樣品制備方法進行處理，取上清液進樣20 μl，記錄色譜圖。分別計算補骨脂素、異補骨脂素與內標物質的峰面積比值Y，代入標準曲線求得補骨脂素和異補骨脂素的濃度。將各組不同時間點取血測得的血藥濃度－時間數據用DAS 2.0藥代動力學分析軟件處理，得主要藥代動力學參數。數據見Tab 1。血藥濃度－時間曲線見Fig 2，3，擬合的藥－時曲線符合po給藥二室模型。

3 討論

本實驗建立了RP-HPLC法測定補骨脂中的補骨脂素、異補骨脂素在大鼠體內血藥濃度測定方法，并進行了藥代動力學初步研究，以7-甲氧基香豆素作為內標準物，減少系統誤差;試驗中，選擇內標物質時，比較了羥甲香豆素、歐前胡素、聯苯胺、7-甲氧基香豆素等物質，其中羥甲香豆素、聯苯胺與含藥血漿中固有成分有干擾;歐前胡素出峰時間太長造成分析周期過長，綜合考慮采用與補骨脂素和異補骨脂素性質類似的7-甲氧基香豆素作為內標物質。

Fig 1 The HPLC chromatograms of reference substance，plasma with reference substance，blank plasm and pastille serum of drug

Fig 2 The drug-time curve of psoralen of different extracts

Fig 3 The drug-time curve of isopsoralen of different extracts8

不同工藝產物中的補骨脂素和異補骨脂素的藥代動力學參數比較［5－6］，從MRT來看，常規粉末組＞超微粉組＞水提取物組＞半仿生組，而Tmax為常規粉末組＞水提取物組＞超微粉組＞半仿生提取物組，但異補骨脂素Tmax超微粉組＞水提取物組，表明常規粉末較超微粉末在在大鼠體內滯留的時間長，達峰時間也較長，與其粉碎粒徑有很大的關系，其次，補骨脂經提取后，能夠促進補骨脂素、異補骨脂素的吸收，縮短達峰時間，更有利于有效成分的吸收和利用;從水提物和半仿生提取物測定結果來看，表明半仿生提取法更符合人體胃腸道吸收原理，模擬藥物口服后，經過的酸性、中性、堿性環境，使其有效成分在提取的過程中，轉化成易吸收的形式存在。從AUC和Cmax結果比較，超微粉組＞常規粉末組＞半仿生提取物＞水提取物，表明超微粉組的生物利用度最好，Cmax也最大，在相同生藥量給藥的條件下，均優于半仿生提取物組和水提取物組，含量測定表明超微粉中補骨脂素和異補骨脂素總量均小于其他組，可以得出，超微粉碎技術在實現藥材細胞級破壁微粉碎的同時，使其細胞內的有效成分暴露出來，藥物的釋放速度及釋放量增加，大幅度提高了藥效成分的利用率;同時，藥材經超微粉碎后，很多有助于被測成分吸收的成分也被釋放出來。綜上所述，從藥物在體內的吸收利用程度考慮，利用藥代動力學特征評價提取工藝的好壞，更能有利于優選最佳提取工藝，本實驗結果表明，藥材經提取后，并沒有提高主成分的吸收率，可能是煎煮過程中，破壞了能夠促進主成分吸收的成分;超微粉碎后的藥材粉末更有利于大鼠吸收，關于補骨脂不同工藝產物在大鼠體內代謝情況將進一步研究探討。

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