離體和在體大鼠心肌細(xì)胞凋亡模型的建立

姚玲玲，黃曉偉，朱依純

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032)

心肌細(xì)胞凋亡是心臟缺血/再灌注(I/R)損傷中導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的原因之一。例如，在慢性心肌缺血(尚未達(dá)到心肌梗死的程度)區(qū)域，或在急性心肌梗死的梗死區(qū)周邊，甚至在急性心肌梗死早期的梗死區(qū)，常伴有程度不等的心肌細(xì)胞凋亡［1－2］。尋求能夠抗心肌細(xì)胞凋亡的藥物和干預(yù)手段成為心血管臨床和基礎(chǔ)研究的一個(gè)主要領(lǐng)域。因此，本研究擬通過離體和在體心肌細(xì)胞凋亡模型的建立，對(duì)其基本特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，為心肌梗死機(jī)制的研究以及保護(hù)心肌藥物的篩選提供合適的離體和在體模型。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物Sprague-Dawieg(SD)大鼠，出生1～2 d;♂ WKY大鼠8只，體質(zhì)量140～160 g，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑及儀器細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12)購(gòu)自Sigma公司;0.1%胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司。DHX-150小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自成都儀器廠。

1.3模型的建立離體細(xì)胞凋亡模型:1～2 d的SD大鼠15～20只，消毒皮膚后剪開胸廓，取下心臟，剪成1 mm3的碎塊，0.1%胰酶37℃水浴中預(yù)消化10 min，自然沉淀?xiàng)壣锨澹貜?fù)1次;加入10～15 ml 0.1%胰酶，37℃水浴攪拌15 min后取上清，5%特級(jí)小牛血清終止消化，1 500 r·min－1離心3 min后棄上清得細(xì)胞沉淀，2 ml完全培養(yǎng)液(DF12，10%小牛血清)使細(xì)胞重懸，重復(fù)這一消化步驟3～4次，收集所有的細(xì)胞懸液，混勻置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，小心吸出未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×108個(gè)·L－1接種培養(yǎng)。心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用無糖無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基換成Hank's平衡液后，將細(xì)胞放在37℃、95%氮?dú)猓?%CO2的環(huán)境中30 min，再重新放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。

在體心肌梗死細(xì)胞凋亡模型:大鼠稱重后腹腔注射6%水合氯醛溶液5×10－3L·g－1，麻醉，仰臥固定，氣管插管，連呼吸機(jī)，備皮，以心尖搏動(dòng)最強(qiáng)的點(diǎn)為中心，作一橫行切口，長(zhǎng)度3～5 cm，顯露肋骨，由第4肋間入胸暴露心臟，從左心耳下方2～3 mm入針，縫扎，在結(jié)扎的時(shí)候放入一小段PE管，以備再灌注的時(shí)候用。結(jié)扎30 min后，將小PE管取出，進(jìn)行再灌注2 h。

1.4觀察的指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1TUNEL法測(cè)原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡情況將種有細(xì)胞的蓋玻片放在固定液中室溫固定20 min，通透液中(0.2%TitonX-100，3%枸櫞酸鈉的PBS溶液)冰上通透2 min，每片加50 μl TUNEL反應(yīng)液濕盒中37℃ 60 min避光孵育，PBS中洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，接受波長(zhǎng)530 nm。

1.4.2TUNEL法測(cè)梗死心肌周邊區(qū)凋亡細(xì)胞直接將心臟取出，PBS中洗去血液，放入4%多聚甲醛中過夜，30%蔗糖中脫水至心臟下沉，進(jìn)行冰凍切片，TUNEL染色，觀察拍照。

1.4.3凋亡細(xì)胞DNA的檢測(cè)細(xì)胞用PBS洗3次，胰酶消化，離心，取沉淀，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，溶解于30 μl TE中。瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min后凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以±s表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞凋亡缺氧30 min復(fù)氧2 h引起原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞凋亡，TUNEL染色呈現(xiàn)大量陽性細(xì)胞(Fig 1，F(xiàn)ig 2)。

Fig 1 Hypoxia/rexygen-induced cardiomyocyte apoptosis measured with TUNEL staining

Fig 2 Hypoxia/reoxygen-induced cardiomyocyte apoptosis

2.2 DNA ladder檢測(cè)DNA凝膠電泳結(jié)果顯示凋亡誘導(dǎo)組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的帶狀條紋，經(jīng)檢測(cè)后為180 bp的倍數(shù)，而對(duì)照組只有一條大分子量的DNA條帶。見Fig 3。

Fig 3 Hypoxia/reoxygen-induced cardiomyocyte DNA ladder production

2.3心梗模型造成的大鼠心肌細(xì)胞凋亡心臟缺血30 min，再灌注2 h后進(jìn)行心臟冰凍切片的TUNEL染色看到大量凋亡細(xì)胞(見Fig 4)。

Fig 4 Ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte apoptosis in the area of risk in vivo

3 討論

心肌梗死是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，利用溶栓療法、血管重建等方法的應(yīng)用，可使缺血心肌恢復(fù)血流再灌注。但是缺血心肌功能未必恢復(fù)，有時(shí)反而損傷加重，心肌細(xì)胞凋亡在缺血/再灌注損傷中的作用長(zhǎng)期以來受到關(guān)注，如何保護(hù)心肌細(xì)胞，減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，減小梗死周邊危險(xiǎn)區(qū)(area of risk)成為心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。體外培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的方法主要有藥物誘導(dǎo)和物理誘導(dǎo)兩種。藥物誘導(dǎo)有應(yīng)用代謝抑制的藥如2-deoxy-D-glucose［3］或Fas凋亡通路激活藥物actinomycin D［4］，或者應(yīng)用離子通道阻斷劑，如氯離子通道阻斷劑staurosporine誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［5］等;而物理誘導(dǎo)主要有缺氧和營(yíng)養(yǎng)剝奪兩種，臨床上心肌梗死發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞同時(shí)受到缺氧和營(yíng)養(yǎng)剝奪兩種傷害，而這兩種刺激因素對(duì)心肌細(xì)胞的損害不完全相同，我們采用的缺氧/復(fù)氧處理法就是一種綜合營(yíng)養(yǎng)剝奪和缺氧刺激的方法，這種處理能夠快速造成心肌細(xì)胞凋亡，有利于我們觀察到藥物對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，譬如可以在細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理前給予藥物預(yù)處理一段時(shí)間，再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧損傷，觀察藥物的作用。

大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎造成心肌梗死的模型現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛采用［6－7］。這是一種急性梗死的模型，相對(duì)于用動(dòng)脈環(huán)造成的慢性心肌缺血模型，其動(dòng)物來源方便(慢性心肌缺血模型多在小型豬身上制作)，操作便捷，造價(jià)低廉，可重復(fù)性強(qiáng)，缺血30 min，再灌注2 h后，在梗死灶周邊區(qū)有大量凋亡細(xì)胞的存在，如何保護(hù)這些凋亡細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)其凋亡的通路，恢復(fù)其功能是值得探索的很有價(jià)值和意義的課題。

綜上所述，原代心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷引發(fā)的凋亡模型和在體大鼠缺血/再灌注損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡模型具有操作簡(jiǎn)單、成功率高等特點(diǎn)，可以用于心肌梗死機(jī)制的研究以及保護(hù)心肌藥物的篩選。

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