紫草素通過ROS/p38信號通路誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡

張亞宏，甘 瑩，郭子華，謝松強

(1.河南大學天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封 475004;2.開封市中醫院腦病科，河南開封 475000)

紫草素(shikonin)是從紫草科植物紫草的根中提取出的一種有效成分，其化學結構為萘醌類化合物，具有抗炎、抗腫瘤等作用［1－2］。文獻報道可以誘導多種腫瘤細胞發生凋亡，但是其凋亡機制還不甚明了［3－4］。ROS是生物體有氧代謝過程中產生的一類活性含氧化合物的總稱，其在細胞凋亡中發揮著重要的作用［5－6］。本文選用人宮頸癌HeLa細胞為研究對象，研究shikonin對腫瘤細胞生長的抑制作用，并探討其機制是否與ROS有關。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑紫草素(shikonin)購于中國藥品生物制品檢定所;應用時用二甲基亞砜(DMSO)溶解，并使DMSO的終濃度低于0.01 g·L－1。甲基噻唑藍(MTT)、DMSO、碘化丙啶 (PI)和RNase A均購于美國 Sigma公司;p38MAPK 抑制劑(SB203580)購于美國Calbiochem公司。caspase-3、p-p38及β-actin的單克隆抗體及辣根過氧化酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購于Santa Cruz Biotechnology公司。RPMI 1640培養基(Gibco，USA)，胎牛血清為北京元亨圣馬生物試劑公司產品。

1.2細胞培養人宮頸癌HeLa細胞購自美國A-merican Type Culture Collection(ATCC)。細胞單層接種在含體積分數為10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，在37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.3細胞生長抑制實驗取對數生長期的HeLa細胞，以每孔1.5×104個細胞埋入96孔板。培養24 h后，加入不同濃度的shikonin;或在加入不同濃度抑制劑 1 h 后，加入35 μmol·L－1的 shikonin。每組設置3個復孔，同時設置陰性對照。置于培養箱中繼續培養至不同時間點，每孔加入5 g·L－1MTT 10 μl再培養3 h后，吸棄上清液，每孔加入 150 μl DMSO溶解，于酶標儀492 nm下測定各孔吸光值(A值)，根據以下公式計算抑制率:

1.4細胞形態學觀察以每孔5×105個細胞的密度接種于6孔板中，培養24 h后加入濃度為0和35 μmol·L－1的 shikonin，用倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

1.5流式細胞儀分析ROS的產生及細胞凋亡率［6－7］以每瓶1×106個細胞分瓶，24 h后在加入不同濃度抑制劑后，加入 35 μmol·L－1的 shikonin，作用相應的時間。收集細胞，用PBS清洗1次。若觀察 ROS 的產生，則加入 10 μmol·L－1的 DCF-DA孵育45 min后上機分析。若觀察細胞凋亡的變化，則用70%乙醇固定過夜。次日將單細胞懸液離心棄去固定液，用PBS洗滌1～2次，加入50 mg·L－1(0.1 g·L－1RNase，PBS 配制)PI染色液 1.0 ml，置4℃避光染色1 h后上流式細胞儀分析，測定細胞內DNA分布情況。

1.6Western blot分析蛋白的表達［6］以每瓶1×106個細胞分瓶，24 h 后加入 35 μmol·L－1的 shikonin，或在加入5 mmol·L－1NAC 1 h 后加入35 μmol·L－1的shikonin，作用相應的時間。收集細胞，用100 μl細胞裂解液冰浴裂解1 h，15 000×g離心5 min，收集上清。經Bio-Rad法進行蛋白定量后以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，50 g·L－1脫脂奶粉封閉后，一抗封閉過夜，再以辣根過氧化酶標記的二抗封閉液封閉2 h，以二氨基聯苯胺溶液顯色，掃描記錄。

1.7數據統計分析如無特殊提示，所有實驗結果均得自3次獨立實驗，數據用±s表示，用SPSS 13.0軟件中的ANOVA進行統計比較。

2 結果

2.1Shikonin誘導HeLa細胞凋亡的作用Shikonin可時間和劑量依賴性的誘導HeLa細胞發生生長抑制。如 Fig 1A 所示:10 到 100 μmol·L－1shikonin對HeLa細胞生長具有不同程度的抑制作用。其在6、12、24和36 h的 IC50值分別是104.9，74.9，33.8 和 29.1 μmol·L－1。在24 h 時，35 μmol·L－1shikonin可誘導明顯的生長抑制，因此，選用其為以下研究的濃度。35 μmol·L－1shikonin作用于HeLa細胞24 h后，細胞發生明顯的形態學變化，細胞皺縮、變圓，并出芽形成明顯的凋亡小體(Fig 1B)。此外，35 μmol·L－1shikonin 作用于細胞 6、12、24 h后，caspase-3前體procaspase-3的表達時間依賴性的減少(Fig 1C)。

2.2Shikonin誘導HeLa細胞ROS的產生ROS的探針DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜進入細胞，在胞內可以被酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通透細胞膜，其在細胞內的ROS的作用下被氧化生成有熒光的DCF，其熒光強度與細胞內ROS水平成正比。如 Fig 2 所示，35 μmol·L－1shikonin作用于HeLa細胞12 h及24 h后，均可以誘導大量ROS的產生。

2.3ROS和p38對shikonin誘導HeLa細胞凋亡的影響加入活性氧的清除劑5 mmol·L－1NAC及10 μmol·L－1p38 MAPK 的特異性抑制劑 SB203580后，由shikonin誘導的HeLa細胞生長抑制率及凋亡率均明顯降低，而單獨加入 NAC或 SB203580對HeLa細胞的生長抑制率及凋亡率均沒有明顯的影響(Fig 3)。

2.4ROS對shikonin誘導HeLa細胞caspase-3及p-p38蛋白表達的影響如 Fig 4所示，35 μmol·L－1shikonin作用于HeLa細胞24 h后，可以誘導procaspase-3表達降低并可以明顯增加p38活性形式p-p38的表達;加入NAC后，下調的procaspase-3及上調的p-p38均有所逆轉;而與對照組相比單獨加入NAC對上述蛋白的表達均未有影響。

Fig 1 Shikonin induces apoptosis in HeLa cells

Fig 2 ROS is induced by shikonin in HeLa cells.

Fig 3 Effects of ROS and p38 on shikonin-induced apoptosis in He-La cells(±s，n=3).

Fig 4 Effect of NAC on the protein expression of procaspase-3 and p-p38 in shikonin-treated HeLa cells.

3 討論

近些年來，天然藥物在腫瘤治療的過程中發揮著重要的作用，目前發現許多天然藥物單體化合物如紫杉醇、苦參堿等都具有較好的抗腫瘤作用［8］;因此，對天然藥物抗腫瘤作用靶點的尋找及其信號轉導機制的研究對腫瘤的治療和天然藥物的發展都至關重要。Shikonin是從天然藥物紫草中提取出的萘醌類化合物，其具有較好的體外抗腫瘤活性［2－4］，在此我們進一步研究了其誘導HeLa細胞死亡的機制。

Shikonin時間劑量依賴性的抑制HeLa細胞生長，倒置顯微鏡下觀察到其可以使細胞浮起、變圓，并出芽形成凋亡小體，而procaspase-3的表達亦隨著作用時間的延長減少。Caspase家族——半胱氨酸蛋白酶為一類與凋亡密切相關的酶類，其在凋亡的進展過程中發揮著重要的作用;其中凋亡效應子的caspase-3被認為是凋亡的標志之一［9］。在凋亡過程中，caspase-3被激活則其前體procaspase-3表達量必然減少。由結果可以看出shikonin明顯的誘導HeLa細胞發生了凋亡。

ROS在細胞的各種生命進程中都發揮著重要的作用，其可作為第二信使調節與細胞增殖、分化、凋亡及自噬相關的信號轉導通路［5－6，10］。在此，我們考察了ROS在shikonin誘導的HeLa細胞凋亡中的作用。Shikonin可以誘導 ROS的產生，清除了ROS后，shikonin所引起的細胞生長抑制和凋亡均被抑制，而由shikonin引起的procaspase-3表達的減少亦被逆轉，證明ROS在shikonin誘導的凋亡中發揮著重要的作用。有研究表明［11］，水飛薊賓可以通過激活ROS/p38信號通路誘導HT1080細胞死亡。p38激酶是有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一員，其在細胞凋亡過程中發揮著舉足輕重的作用［12］。因此，我們探討了p38在此凋亡中的作用。加入p38特異性抑制劑SB203580后，與加入NAC結果一致，shikonin所引起的細胞生長抑制和凋亡均被抑制;而加入shikonin后，p-p38表達明顯增加，表明p38被激活，證明shikonin通過激活p38而誘導HeLa細胞凋亡，即p38亦參與了shikonin誘導的HeLa細胞的凋亡過程。隨后，再加入NAC預處理后，p-p38的表達與的單獨加shikonin組相比有明顯的降低，表明在此過程中ROS是通過調節p38的活性來誘導凋亡的。

由此可以得出結論，shikonin通過誘導ROS的產生，既而激活p38而介導HeLa細胞凋亡，從而發揮其抗腫瘤作用。

［1］Tanaka S，Tajima M，Tsukada M，Tabata M.A comparative study on anti-inflammatory activities of the enantiomers，shikonin and alkannin［J］.J Nat Prod，1986，49(3):466 －9.

［2］Mao X，Yu C R，Li W H，Li W X.Induction of apoptosis by shikonin through a ROS/JNKmediated process in Bcr/Abl-positive chronic myelogenous leukemia(CML)cells［J］.Cell Res，2008，18(8):879－88.

［3］吳 振，吳立軍，田代真一，等.紫草素誘導A375-S2細胞凋亡的分子機制研究［J］.中國藥理學通報，2005，21(2):202－5.

［3］Wu Z，Wu L J，TASHIRO S I，et al.Studies on the mechanisms of shikonin-induced A375-S2 cell apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(2):202 －5.

［4］Han W D，Li L，Qiu S，et al.Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death［J］.Mol Cancer T-her，2007，6(5):1641 －9.

［5］Liu B，Cheng Y，Zhang B，et al.Polygonatum cyrtonema lectin induces apoptosis and autophagy in human melanoma A375 cells through a mitochondria-mediated ROS-p38-p53 pathway［J］.Cancer Lett，2008，275(1):54 －60.

［6］Yang J，Wu J N，Tashiro S，et al.Critical roles of reactive oxygen species in mitochondrial permeability transition in mediating evodiamine-induced human melanoma A375-S2 cell apoptosis［J］.FreeRadic Res，2007，41(10):1099 －108.

［7］Hotz M A，Delbino G.Cytosatic and cytotoxic effects of FST on human promyelocytic HL-60 and lymphcytic molt-4 leukemic cells［J］.Cancer Res，1992，52(6):1530 －5.

［8］郭啟帥，黃 曦，李少林.苦參堿誘導卵巢癌SKOV_3細胞凋亡的機制研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(8):1104－7.

［8］Guo Q S，Huang X，Li S L.Effects of matrine on apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV_3 and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1104 －7.

［9］Nicholson D W.Caspase structure，proteolytic sub-strates，and function during apoptotic cell death［J］.Cell Death Differ，1999，6(11):1028.

［10］Mojgan D M，Maneulla A，Julie M.Regulation of autophagy by NF-κB transcription factor and reactives oxygen species［J］.Autophagy，2007，3(4):390 －2.

［11］Duan W J，Li Q S，Xia M Y，et al.Silibinin activated ROS-p38-NF-κB positive feedback and induced autophagic death in human fibrosarcoma HT1080 cells［J］.J Asian Nat Prod Res，2011，13(1):27－35.

［12］Suzuki K，Hino M，Kutsuna H，et al.Selective activation of p38 mitogen-activated protein kinase cascade in human neutrophils stimulated by IL-1 beta［J］.J Immunol，2001，167(10):5940 －7.