BAPTA-AM對HepG-2細胞MT的保護作用及其機制

付再林，宋必衛，施水娟，楊 毅

(浙江工業大學藥學院，浙江杭州 310014)

線粒體(mitochondria，MT)是細胞內氧化磷酸化主要場所，在維持細胞生命活動中起著極為重要的作用。MT的損傷可致細胞能量供應中斷，MT內Ca2+超載，細胞內自由基水平升高，MT膜屏障功能減低甚至喪失，膜通透性增加、跨膜電位降低、細胞色素C釋放等并激活下游凋亡信號通路［1－2］。這些改變將直接或間接導致細胞凋亡(apoptosis)和壞死(necrosis)［3］。大量細胞急性死亡是臨床危、重、急癥如急性肝衰竭、中風等病的共同病理基礎，持續的細胞死亡是許多慢性疾病如帕金森病、老年性癡呆的發病且不斷惡化的原因［4］。盡管在細胞死亡機制研究方面已有長足進步，但目前仍然缺乏減少細胞死亡的有效藥物，搶救瀕危細胞以挽回生命的藥物為臨床亟需。

鈣超載是公認的細胞損傷、死亡的共同環節［5］。理論上，迅速降低細胞內鈣，消除鈣超載，逆轉細胞死亡進程，是挽救瀕危細胞可行手段。BAPTA-AM［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'N'-tetraacetic acid］是一種進入細胞后活化的高效鈣絡合劑，廣泛用于控制細胞內鈣水平［5］。本研究以H2O2損傷HepG-2細胞，通過測定MT膜電位、細胞色素C的釋放、Caspase-9及 ROS的激活等，觀察BAPTA-AM對MT的保護作用，探討其可能的作用機制，期望發現一種強有力的搶救瀕危細胞藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑HepG-2細胞株購自南京凱基生物科技發展有限公司;BAPTA-AM由合肥恒星藥物研究所提供;Rhodamine123、MTT購自Sigma公司;細胞色素C(CytC)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒，購自Uscn-life公司;Caspase-9活性檢測試劑盒、活性氧ROS檢測試劑盒購自海門市碧云天生物技術研究所;RPMI 1640培養液、小牛血清、0.25%胰蛋白酶購自上海吉諾醫藥生物技術有限公司。

1.1.2儀器垂直流超凈臺(ESCO，SCV-4A1);CO2培養箱(Thermo Electron，Forma 3111);熒光顯微鏡(Leica Devices);酶標儀(Molecular Devices，Spectramax M2e);離心機(Heraeus，LDZ5-2)。

1.2 方法

1.2.1H2O2誘導HepG-2細胞損傷模型的建立［6－7］將細胞以 104/孔接種于 96 孔板，RPMI 1640培養液培養至細胞生長到70%～80%孔面積。加入終濃度 500 μmol·L－1的 H2O2，分別培養 0、3、6、9、12、15和 24 h，每組設 8 個復孔。MTT 法檢測細胞活力:終止培養后加終濃度0.5%的MTT，37℃孵育4 h后DMSO溶解，酶標儀(λ=570 nm)記錄各孔吸光度。

1.2.2BAPTA-AM對H2O2誘導HepG-2細胞損傷的影響細胞分為正常對照組、H2O2損傷組、BAPTA-AM(10－8－10－5mol·L－1)4 個保護組。每組8個復孔。保護組分別加入相應濃度的BAPTA-AM培養1 h后，模型組和各保護組均加入500 μmol·L－1H2O2，繼續培養9 h，MTT法檢測細胞活力。

1.2.3MT膜電位(MMP)的檢測［6－7］Rh 123 為膜電位敏感的親脂性陽離子熒光染料，能選擇性地在活細胞MT內聚集，發出黃綠色熒光，其強度可以間接反映MT膜電位(MMP)的高低。細胞接種、分組與處理同“1.2.2”，每組設3個復孔。棄培養液，PBS清洗兩次后加含100 μg·L－1Rh 123的無血清培養基中37℃孵育45 min，棄培養液，PBS清洗多次至背景較淺，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4胞質內細胞色素C(CytC)含量測定［6－7］細胞接種于6孔板中，分組與處理同“1.2.2”，收集細胞，PBS稀釋使細胞濃度達到200萬·ml－1。通過液氮反復凍融破壞細胞以釋放出細胞內成份，離心10 min(10 000 r·min－1)收集上清，ELISA法測定CytC含量(按試劑盒說明書操作)。

1.2.5細胞內Caspase-9活性檢測［6－7］細胞接種、分組與處理同“1.2.4”，收集細胞，按每200萬細胞加入100 μl的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴中裂解 15 min，4℃ 離心 15 min(15 000 r·min－1)。按試劑盒說明書檢測Caspase-9催化底物Ac-LEHD-pNA(acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)產生的黃色pNA量，405 nm測定pNA吸光度確定Caspase-9的活性。

1.2.6細胞內活性氧(ROS)含量的測定［8］2'，7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)進入細胞后被胞內酯酶水解成不能透過細胞膜的DCFH，從而將探針載入胞內。胞內ROS可將無熒光的DCFH氧化成發出綠色熒光的DCF。其熒光的強弱可以間接反映細胞內ROS的水平。同“1.2.2”分組與處理，PBS清洗細胞兩次，加 10 μmol·L－1DCFH-DA，37℃孵育30 min，棄 DCFH-DA，PBS清洗多次至背景較淺，熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.7統計學處理采用 GraphPad Prism 5.0軟件，數據用±s表示，用One-way或Two-way ANOVA檢測均數差異顯著性。

2 結果

2.1 BAPTA-AM明顯提高受H2O2攻擊的HepG-2細胞活力H2O2作用細胞9 h，細胞活力僅為正常對照組的56.1%(Fig 1)。BAPTA-AM濃度依賴性地減輕細胞損傷，在10－6mmol·L－1時效果最佳(活力為93.4%)，再增大劑量則作用有所減弱。

Fig 1 BAPTA-AM protects HepG-2 cells against H2O2-induced injury(MTT method，±s，n=8).

2.2 BAPTA-AM抗H2O2所致的MMP降低由Fig 2可見，H2O2攻擊9 h使MT攝取Rh123能力降至正常細胞的7%，MMP崩潰。BAPTA-AM濃度依賴性防止MT對Rh123的攝取能力的潰損，濃度為10－6mol·L－1時作用最佳(與“2.1”結果一致)，表明BAPTA-AM能有效減輕H2O2所致的MT損傷，穩定MMP，維持膜功能。

2.3BAPTA-AM明顯抑制CytC的釋放由Fig 3A可知H2O2攻擊下胞質內CytC明顯增加(由MT釋放)，12 h時累積量最大。隨著損傷時間延長，細胞大量死亡、殘留細胞少，故24 h測得的CytC量很低，因此以損傷12 h為觀察藥效時間點。BAPTAAM明顯抑制 CytC的釋放(Fig 3B)，濃度為10－6mol·L－1時作用最佳，增加濃度作用反而減弱，與上述結果一致。

2.4BAPTA-AM防止Caspase-9激活Caspase-9的激活可反映出以MT為核心的內源性凋亡通路的激活程度。由Tab 1可知Caspase-9活性隨時間延長而增高，6～12 h模型組Caspase-9催化產生的pNA量與正常對照組比較差異有顯著性，表明損傷已激活Caspase-9，BAPTA-AM明顯抑制Caspase-9激活，10－7mol·L－1時 Caspase-9 的活性已近正常對照組水平，隨著濃度增加 Caspase-9的活性可降低至正常基礎值以下。

Tab 1 BAPTA-AM prevents the activation of caspase-9 induced by H2O2attack in HepG-2 cells(n=3)

Fig 2 Mitochondrial membrane potential(MMP)labeled with rhodamine123 and detected by fluorescence microscope.BAPTAAM protects mitochondrial membrane against MMP drop induced by H2O2injury.

2.5BAPTA-AM抑制ROS的產生由Fig 4可見細胞損傷(模型組)大量生成ROS，BAPTA-AM濃度依賴性減少ROS的產生，從而抑制ROS對細胞的損傷。

3 討論

Fig 3 Inhibitory effect of BAPTA-AM on cytochrome C(CytC)release from mitochondria induced by H2O2attack(±s，n=3).

MT和Ca2+超載在細胞死亡中的作用 MT是細胞有氧代謝中心和能量供應站，也是ROS產生中心。MT結構和功能的完整是細胞正常生命活動的前提。缺血缺氧致代謝和能量障礙、炎癥、化學毒性攻擊等損傷因素均可損傷MT。能量障礙使離子轉運失常，形成Ca2+超載。Ca2+超載的危害:(1)刺激ROS過度生成，攻擊膜、蛋白質、核酸，致細胞損傷并加重鈣超載，形成惡性循環;(2)MT電子傳遞和ATP生成脫偶聯，加重能量障礙;(3)Ca2+和ROS共同作用，在MT內膜形成通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，膜通透性高，造成MT腫脹，ATP耗竭，膜電位降低，引起細胞凋亡和壞死;同時MT外膜形成大孔徑的凋亡誘導通道(mitochondrialapoptosis-induced channel，MAC)，CytC經此通道釋放到細胞質，與Apaf-1蛋白結合后，再寡聚成凋亡小體，激活Caspase-9，始動凋亡后期Caspases級聯反應［9］。(4)直接或間接激活蛋白酶、核酸內切酶，如使細胞結構蛋白、核酸水解，細胞死亡［1］。(5)其它作用:例如Ca2+通過Calpain激活Caspase-12，啟動內質網應激凋亡(apoptosis by ER stress)通路，通過促進ROS產生，激活應激致活蛋白激酶JNK信號通路產生凋亡與壞死(TNF-α-死亡受體信號亦參與該通路激活)等［10］。由于Ca2+可通過多種離子通道、轉運蛋白、內源儲庫釋放、直接通過損傷的膜等多種途徑進入細胞質，Tymianski等認為必須采用多種阻滯藥聯合應用才能阻斷Ca2+內流以保護細胞。

Fig 4 BAPTA-AM blocks the generation of ROS in HepG-2 cells induced by H2O2attack.

BAPTA-AM的優勢［11］:(1)目前臨床可用的鈣拮抗劑只能選擇性阻滯Ca2+自某一亞型鈣通道內流，并且對已形成的細胞內Ca2+超載無作用，難當抗細胞死亡重任。(2)細胞凋亡、壞死機制復雜，涉及的信號通路和信號分子很多，僅阻斷某一環節對改善全局幫助不大。(3)Ca2+超載在多環節參與細胞死亡信號過程。理論上，直接降低［Ca2+］i，迅速消除Ca2+超載，恢復細胞內Ca2+穩態，可在多環節協同產生高效有益作用，是目前最佳可選策略。(4)BAPTA-AM是一種快速高效的細胞內Ca2+絡合劑，有效控制［Ca2+］i。是迅速消除Ca2+超載的最佳選擇。

基于以上觀點，我們致力于BAPTA-AM抗細胞損傷作用的研究，證實其確能多環節抗細胞死亡，結果令人興奮:(1)BAPTA-AM能有效消除Ca2+超載［11］，抗D-氨基半乳糖所致的肝細胞凋亡與壞死。細胞損傷后，［Ca2+］i明顯升高;BAPTA-AM劑量依賴性降低受損細胞［Ca2+］i，濃度為 10－6mol·L－1時使受損細胞［Ca2+］i降低至正常細胞水平。(2)本文工作進一步證明BAPTA-AM可有效保護HepG-2細胞，減輕H2O2攻擊所致的細胞活力下降，其機制包括:減少細胞ROS生成;減少MT損傷，維持膜電位;抑制CytC釋放而抑制MT凋亡通路的激活;抑制Caspase-9激活。Caspase-9是MT凋亡通路起始物，其活性抑制表明該通路受到抑制。(3)我們有資料(另文發表)表明BAPTA-AM也明顯抑制Caspase-8的激活，提示該藥也能抑制凋亡的死亡受體通路。動物實驗結果支持BAPTA-AM作用的高效性:靜脈注射 BAPTA-AM 1-2.5 mg·kg－1，使 D-氨基半乳糖與內毒素(LPS)所致的極性肝衰竭小鼠死亡率大大降低。以上結果相互支持。文獻報道［11］BAPTA-AM能抑制H2O2誘導的家兔腎近端小管細胞的死亡，減輕肺主動脈內皮細胞的氧化損傷，抑制Caspase-12和JNK的活化，逆轉Cardiotoxin-Ⅲ的細胞毒性，使因大腦中動脈閉塞引起的腦梗死體積減小50.5%，均與本課題組工作一致。BAPTAAM對其它重要信號通路如TNF-α、Bcl蛋白、NF-κb也可能產生影響，我們將作進一步觀察。就已有的結果看，BAPTA-AM作為抗細胞死亡、搶救瀕危細胞藥物，有良好的進一步研發前景。

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