青蒿素的免疫抑制作用及其調(diào)控機(jī)制研究

李 覃，陳 虹，梅 昕，那春祺，韋 娜，曹 波，白淑芳

(1.天津武警醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，2.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.天津武警醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室，天津 300162)

近年來，隨著工業(yè)化程度的逐步提高，自身免疫性疾病、超敏反應(yīng)性疾病等由免疫反應(yīng)過度而引起的疾病也在不斷增加，尋找高效低毒的免疫抑制劑已成為當(dāng)前一個(gè)研究熱點(diǎn)。有證據(jù)表明，中藥免疫抑制劑具有高效低毒的特殊療效，但由于制劑質(zhì)量難以控制、作用機(jī)制難以明確，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。采用現(xiàn)代提取分離技術(shù)，從中藥中獲得具有免疫抑制活性的單體化合物，將克服這些不足，并有望創(chuàng)制免疫抑制新藥。青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL的干燥地上部分，主要含有青蒿素、青蒿甲素、青蒿丙素、青蒿酸、青蒿內(nèi)酯、黃酮、香豆素和揮發(fā)油等成分，具有清熱解暑、除蒸、截瘧等功效［1］。其中，化學(xué)單體青蒿素(artemisinin，Art)由我國藥學(xué)家首先于20世紀(jì)70年代提取分離得到，分子式C15H22O5(Fig 1)，是我國第一個(gè)被WHO認(rèn)可按西藥研究標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)的高效抗瘧藥。由于腦型瘧疾的發(fā)病機(jī)制與自身免疫有關(guān)，因此人們推測(cè)Art除直接殺滅瘧原蟲外，還可能具有免疫調(diào)節(jié)作用。通過近十年的實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，青蒿素具有一定的免疫抑制活性，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病都顯示出不同程度的治療或保護(hù)作用［2］，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本文通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討青蒿素調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)及其免疫抑制的作用機(jī)制。

Fig 1 Chemical structure of artemisinin

1 材料與方法

1.1主要材料Art(純度99.5%)購于鄭州荔諾生物科技發(fā)展有限公司;DMSO、MTT、二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)、ConA、地塞米松(dexamethasone，Dex，純度≥ 98%)購于 Sigma 公司;RPMI 1640、胎牛血清(FCS)購于 Gibco公司;p38 MAPK及其磷酸化抗體Phospho-p38 MAPK(Thy180/Tyr182)購于Santa Cruz公司，WST-1細(xì)胞增殖試劑盒、p-38MAPK抑制劑SB203580購于碧云天公司;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購于Pierce公司;TGF-β1 ELISA試劑盒購于R＆D公司;ICR小鼠(6～8周齡，♀)購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證SCXK-(軍)2007-004。

1.2細(xì)胞懸液的制備小鼠眼球取血處死，無菌分離小鼠頸部、頜下、鎖骨下、腋窩等處淋巴結(jié)，200目篩網(wǎng)研磨過濾，收集細(xì)胞懸液，洗滌3次(4℃，250×g，5 min)，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%熱滅活FCS，100 ku·L－1青霉素 － 鏈霉素)調(diào)細(xì)胞密度為1 ×109·L－1。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及增殖活性分析Art溶于DMSO成1 mmol·L－1，濾過除菌，－20℃貯存，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO終濃度不高于0.1%，該濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響)。檢測(cè)ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)分組如下:空白本底(只加RPMI 1640完全培養(yǎng)基)、對(duì)照組(5 mg·L－1Con A)和不同濃度Art干預(yù)下的ConA實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)48 h。按照WST-1細(xì)胞增殖試劑盒說明，每孔加20 μl WST-1溶液，450 nm處測(cè)定光吸收度(A值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率/%=(對(duì)照組A均值－實(shí)驗(yàn)組A均值)/(對(duì)照組A均值－空白本底A均值)×100%。以地塞米松(Dex)作為陽性對(duì)照藥物。同時(shí)，另設(shè)DMSO溶劑對(duì)照組，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。

1.4MTT法檢測(cè)藥物毒性參照文獻(xiàn)，以MTT法檢測(cè)藥物的毒性作用［3］。將已制備好的單細(xì)胞懸液接種于96孔板，設(shè)空白本底、對(duì)照組(只加淋巴細(xì)胞懸液)、實(shí)驗(yàn)組(加入相應(yīng)濃度的藥物)。48 h后，加入5 g·L－1MTT 20 μl，37C 避光孵育4 h，250×g離心5 min，棄上清，加入100 μl/孔 DMSO 溶解甲臜結(jié)晶，于490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔A值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)存活率。相對(duì)存活率/%=［(A實(shí)驗(yàn)組－A空白本底)/(A對(duì)照組－A空白本底)］×100% 。同時(shí)，另設(shè)DMSO溶劑對(duì)照組觀察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。1.5動(dòng)物模型的建立及給藥方法以典型的細(xì)胞免疫反應(yīng)——遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity，DTH)為指標(biāo)，體內(nèi)給藥探討 Art的免疫調(diào)節(jié)功能。參照文獻(xiàn)方法［4］建立DTH小鼠模型:實(shí)驗(yàn)前1 d小鼠腹部去毛約3 cm。開始日(d 0)和d 1于去毛部位涂0.5%DNFB(以4∶1丙酮橄欖油配制)40 μl致敏。d 6于左耳內(nèi)外側(cè)涂0.3%DNFB 20 μl激發(fā)。誘發(fā)前0.5 h和誘發(fā)后6 h小鼠左耳外涂Art乳膏(本室自制，Art濃度分別為2%、4%、8%)。激發(fā)后48 h處死小鼠。以Dex作為陽性對(duì)照。以乳膏基質(zhì)作為基質(zhì)對(duì)照。同時(shí)另設(shè)正常小鼠對(duì)照組，以相應(yīng)劑量Art處理，觀察正常機(jī)體對(duì)Art是否有毒副反應(yīng)。

1.6DTH反應(yīng)的測(cè)定頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，游標(biāo)卡尺測(cè)厚度、電子天平稱重量;同時(shí)取小鼠胸腺及脾臟稱重。以左右耳片厚度、重量之差為腫脹度;以每10g小鼠的脾重和胸腺重作為脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)=［胸腺(脾)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)］×10。

1.7RT-RCR法檢測(cè)T-bet、GATA-3的mRNA表達(dá)收集各組小鼠引流淋巴結(jié)，采用異硫氰酸胍法提取組織RNA，分光光度計(jì)測(cè) A260/A280比值在1.8～2.0之間。引物序列由金思特科技有限公司合成如下:T-bet(413 bp):上游引物5'-GATCGTCCTGCAGTCTCTCC-3'，下游引物 5'-AACTGTGTTCCCGAGGTGTC-3';GATA-3(364 bp):上游引物5'-AGTGTGTGAACTGCGGGGCA-3'，下游引物 5'-TCCAGCGCGTCATGCACCTT-3';GAPDH(225 bp):上游引物5'-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物5'-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3'。按照 Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成。PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃ 5 min，94℃ 30 s、57℃ 45 s、72℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用Gel-Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各組條帶。

1.8雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)TGF-β1含量收集各組小鼠耳片組織，置于含0.1%Tween 20的PBS中勻漿，取上清，雙抗體夾心 ELISA法檢測(cè)TGF-β1含量。將抗小鼠TGF-β1單抗包被于酶標(biāo)板，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的TGF-β1與單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物，加入生物素化的抗小鼠TGF-β1抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素、生物素與親和素結(jié)合，加酶底物顯色，用MK3酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定A值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TGF-β1含量。

1.9Western blot檢測(cè)p38 MAPK的活性表達(dá)收集各組小鼠淋巴結(jié)，提取組織蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(phospho-p38 MAPK，1∶1 000)孵育，4℃過夜，TBST洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL法檢測(cè)。用Stripping Solution洗脫、封閉后，再次加入一抗(p38 MAPK，1∶1 000)、二抗，顯影。采用BioRad系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。此外，另建DTH模型，給予p-38MAPK的選擇性抑制劑SB203580(0.2%)進(jìn)行干預(yù)，給藥方式同前，觀察小鼠耳腫脹情況。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1Art對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響如Fig 2所示，各劑量Art對(duì)ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖呈現(xiàn)明顯的抑制作用，與低劑量 3.13 μmol·L－1相比，25～200 μmol·L－1抑制率差異有顯著性。達(dá)到 200 μmol·L－1時(shí)，Art的抑制效應(yīng)甚至高于Dex陽性對(duì)照組。

Fig 2 Artemisinin inhibited ConA-induced lymphocyte proliferation

2.2Art的細(xì)胞毒性作用3.13 ～200 μmol·L－1的Art作用48 h后，細(xì)胞存活率都在70%以上(Fig 3)，毒性低于最高的毒性致死量(一般指50%致死所需的藥物劑量)，因此可認(rèn)為該藥物毒性較小。陽性對(duì)照Dex的毒性作用明顯高于Art(P＜0.01)，最低存活率僅(38.97±3.18)%。此外，實(shí)驗(yàn)條件下DMSO溶劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和活性狀態(tài)均未見明顯影響。

Fig 3 The cytotoxicity of artemisinin

2.3Art抑制DTH小鼠耳腫脹度與DTH模型小鼠相比(Fig 4)，透皮給藥的各劑量Art均明顯抑制小鼠耳腫脹，且呈一定的劑量依賴性。Art對(duì)DTH的抑制效應(yīng)提示其能有效下調(diào)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，乳膏基質(zhì)對(duì)照組對(duì)小鼠未見明顯影響，說明基質(zhì)對(duì)DTH沒有作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

Fig 4 Artemisinin suppressed the DTH in mice

2.4Art對(duì)脾/胸腺指數(shù)的影響DTH模型組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均明顯升高，Art干預(yù)組可降低免疫器官的臟器指數(shù)，差異具有顯著性(Fig 5)。因此，實(shí)驗(yàn)條件下Art顯示出一定的免疫抑制效應(yīng)。與初始體重相比，各劑量Art對(duì)小鼠體質(zhì)量均無明顯影響，而Dex則明顯降低小鼠體質(zhì)量，占初始體質(zhì)量的(97.61±2.85)%，顯示出一定的機(jī)體毒性。此外，接受相應(yīng)劑量Art的正常小鼠未見有何不良反應(yīng)，說明實(shí)驗(yàn)條件下Art對(duì)正常機(jī)體無明顯毒副作用。

2.5Art對(duì)Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的影響T-bet選擇性表達(dá)于Th1細(xì)胞，是Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th1細(xì)胞的分化過程中起決定性作用［5］;GATA-3 則是 Th2 細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子［6］。為探討Art對(duì)Th1/Th2免疫平衡的調(diào)節(jié)作用，采用RT-PCR檢測(cè)T-bet和GATA-3的基因表達(dá)。結(jié)果顯示(Fig 6)，Art能夠抑制T-bet基因表達(dá)，同時(shí)上調(diào)GATA-3的mRNA水平，最終使T-bet/GATA-3比值明顯降低。可見，Art通過影響T-bet和GATA-3基因表達(dá)抑制Th1細(xì)胞分化、促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)Th1和Th2免疫應(yīng)答的平衡。

Fig 5 Effect of artemisinin on body weight and immune organ index

Fig 6 Effect of artemisinin on the T-bet and GATA-3 expression

2.6Art上調(diào)TGF-β1與對(duì)照組相比，Art能夠劑量依賴的增加DTH小鼠耳組織TGF-β1含量，提示通過調(diào)節(jié)TGF-β1水平發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)是其作用機(jī)制之一(Fig 7)。

Fig 7 Effect of artemisinin on the production of TFG-β1

2.7Art抑制Phospho-p38 MAPK的活性表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示(Fig 8)，DTH模型組Phospho-p38 MAPK蛋白表達(dá)較正常組明顯升高，Art干預(yù)組均能抑制p38 MAPK蛋白的磷酸化活性表達(dá)，同時(shí)非磷酸化p38 MAPK表達(dá)無明顯變化。DTH小鼠耳部外用p-38MAPK選擇性抑制劑SB203580后，耳腫脹明顯抑制，與模型對(duì)照組相比差異具有顯著性，而與Dex陽性對(duì)照組無差別，提示p38 MAPK通路或許是Art抑制DTH的的重要途徑之一。

Fig 8 Inhibitory effect of artemisinin on phosphorylated-p38 MAPK expression

3 討論

傳統(tǒng)的免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)激素等在器官移植和自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著重要作用，但這些藥物具有選擇性不強(qiáng)，毒副作用大等缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。而中藥免疫抑制劑具有藥理作用廣泛、毒副作用小、無依賴性等特點(diǎn)，故從天然藥物中尋找提取高效低毒的免疫抑制劑已成為制藥界的熱點(diǎn)。Art是一種天然植物提取物，已被廣泛用于治療瘧疾。此外，它還具有抗腫瘤、抗病毒、抗寄生蟲等多方面的藥理學(xué)作用［7］。近年來，國內(nèi)外研究表明，Art及其衍生物對(duì)免疫系統(tǒng)有著較為復(fù)雜的影響，不同條件下能夠表現(xiàn)出雙向免疫調(diào)節(jié)作用。例如Yang等［8］報(bào)道，Art能增強(qiáng)正常小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，對(duì)免疫功能的重建具有一定作用;而中國科學(xué)院上海藥物研究所的系列研究顯示:蒿甲醚［9］等青蒿素類衍生物具有廣泛的免疫抑制效應(yīng)，包括抑制T細(xì)胞增殖分裂、阻止促炎因子及炎癥介質(zhì)的釋放、抑制B細(xì)胞增殖和抗體分泌等。新近研究顯示［10］，Art的免疫抑制作用甚至強(qiáng)于環(huán)孢素A，可用于自身免疫性疾病的治療，因此對(duì)該類藥物的研究也越來越受到重視。

本研究首先通過體外細(xì)胞培養(yǎng)證明，Art對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，高劑量時(shí)其抑制效應(yīng)甚至高于Dex，而且毒性更低。體內(nèi)研究采用的動(dòng)物接觸性超敏反應(yīng)為皮膚接觸致敏原引起的一種特殊DTH，大多在致敏原激發(fā)后24～48 h到達(dá)高峰，是由特異性致敏T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)［11］。免疫器官(胸腺、脾)不僅是淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，也是產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，其重量降低或升高程度反映了機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，Art明顯降低DTH模型小鼠免疫器官的臟器指數(shù)，減輕耳腫脹度，提示其通過下調(diào)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮免疫抑制作用，而且較Dex顯示出更為優(yōu)越的安全性。

目前認(rèn)為，Th1細(xì)胞是參與DTH的重要細(xì)胞之一，通過分泌干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫;Th2細(xì)胞則分泌白介素-4(IL-4)等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫。Th1和Th2互為抑制細(xì)胞，導(dǎo)致DTH中Th1/Th2免疫失衡。國內(nèi)外已有大量研究通過細(xì)胞因子水平干預(yù)治療來糾正Th1/Th2的免疫失衡，包括用Th2因子基因封閉和Th1因子基因轉(zhuǎn)染，但療效并不滿意。T-bet為Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，是反映Th1釋放細(xì)胞因子的特異性標(biāo)志。GATA-3選擇性表達(dá)于Th2細(xì)胞，是目前確定的唯一能調(diào)控Th2型細(xì)胞因子合成的特異性轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，T-bet可以抑制GATA-3表達(dá)并誘導(dǎo)已分化成熟的 Th2 向 Th1 逆向轉(zhuǎn)化［12－13］，而 GATA-3 在促進(jìn)Th2發(fā)育的同時(shí)也能抑制T-bet，因此，調(diào)控T-bet/GATA-3基因表達(dá)可以從Th1/Th2細(xì)胞分化的上游控制Th1/Th2平衡，克服單一細(xì)胞因子作用的片面性。本研究結(jié)果顯示，Art不僅明顯抑制T-bet基因表達(dá)，而且能夠促進(jìn) GATA-3的表達(dá)，從而影響Th1/Th2細(xì)胞分化。

TGF-β是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的重要調(diào)控因子，可由活化的 T細(xì)胞產(chǎn)生，有 β1、β2、β3三種亞型，其中TGF-β1所占比例最高(＞90%)，活性最強(qiáng)，能抑制淋巴細(xì)胞增生及轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)免疫活性細(xì)胞凋亡［14］。新近研究發(fā)現(xiàn)［15］，體內(nèi)存在一類具有免疫無能和免疫抑制兩大特性的細(xì)胞，稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)，其中誘導(dǎo)性Treg中的Th3細(xì)胞主要通過產(chǎn)生TGF-β抑制Th1和Th2細(xì)胞增殖和功能，從而發(fā)揮免疫抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Art能夠劑量依賴的促進(jìn) TGF-β1產(chǎn)生，提示其通過上調(diào)TGF-β1水平，抑制DTH小鼠的炎癥反應(yīng)，并且還能在抗過敏方面發(fā)揮重要作用。但Art對(duì)TGF-β的影響是否與其促進(jìn)Th3有關(guān)尚需進(jìn)一步研究闡明。

DNFB誘導(dǎo)的DTH是由T細(xì)胞介導(dǎo)的、在多種細(xì)胞因子參與下的皮膚炎癥反應(yīng)，而炎癥過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及相互關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，現(xiàn)已初步證明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路在其中發(fā)揮著重要作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAPKs主要由3個(gè)成員構(gòu)成，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)。其中p38 MAPK作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)在炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［16］。本研究顯示，Art明顯減弱p38 MAPK的磷酸化活性表達(dá)，其對(duì)DTH的抑制效應(yīng)與p-38MAPK選擇性抑制劑SB203580相近。需要指出的是，作為p38 MAPK信號(hào)途徑中重要的上游介質(zhì)，TGF-β1亦可通過MKK介導(dǎo)激活p38 MAPK，繼而通過對(duì)下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化等過程。因此，Art對(duì)TGF-β1與p38 MAPK之間的這種雙向調(diào)控作用的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究闡明。

總之，本研究中，Art能夠明顯抑制ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖及DTH反應(yīng);影響Th1/Th2免疫失衡，促使Th1型免疫應(yīng)答向Th2型轉(zhuǎn)變;促進(jìn)抑制性因子TGF-β1產(chǎn)生以及下調(diào)p38 MAPK信號(hào)。因此，通過對(duì)其獨(dú)特的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，將有利于青蒿素類藥物更廣泛的用于臨床，并為將其開發(fā)成新型免疫抑制藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會(huì)編.中國藥典.一部［S］.2005:113.

［1］State Pharmacopoeia Committee.Chinese Pharmacopoeia［S］.2005:113.

［2］Gavigan C S，Shen M，Machado S G，et al.Influence of the Plasmodium falciparum P-glycoprotein homologue 1(pfmdr1 gene product)on the antimalarial action of cyclosporin［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59(2):197 －203.

［3］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55 －63.

［4］Takeshita K，Yamasaki T，Akira S，et al.Essential role of MHCⅡ-independent CD4+T cells，IL-4 and STAT6 in contact hypersensitivity induced by fluorescein isothiocyanate in the mouse［J］.Int Immunol，2004，16(5):685 －95.

［5］Bowen H，Kelly A，Lee T，et al.Control of cytokine gene transcription in Th1 and Th2 cells［J］.Clin Exp Allergy，2008，38(9):1422－31.

［6］Jenner R G，Townsend M J，Jackson I，et al.The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(42):17876－81.

［7］陸金健.青蒿素類化合物抗腫瘤研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(6):818－20.

［7］Lu J J.Progress in the research on the anti2cancer activ ity of artem isin in compounds［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):818－20.

［8］Yang S X，Xie S S，Gao H L，et al.Artemisinin and its derivatives enhance T lymphocyte-mediated immune responses in normal mice and accelerate immunoreconstitution of mice with syngeneic bone marrow transplantation［J］.Clin Immunol Immunopathol，1993，69(2):143 －8.

［9］Wang J X，Tang W，Shi L P，et al.Investigation of the immunosuppressive activity of artemether on T-cell activation and proliferation［J］.Br J Pharmacol，2007，150(5):652 －61.

［10］Lopez P，Gomez J，Mozo L，et al.Cytokine polymorphism influence treatment outcomes in SLE patients treated with antimalarial drugs［J］.Arthritis Res Ther，2006，8(2):R42.

［11］鄭詠秋，魏偉，戴 敏，等.木瓜總苷抑制小鼠接觸性超敏反應(yīng)及對(duì)其胸腺T淋巴細(xì)胞亞型的調(diào)節(jié)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(9):1016－20.

［11］Zheng Y Q，Wei W，Dai M，et al.Glucosides of chaenomeles speciosasuppressed contact hypersensitivity response via modulating the thymus T lymphocytes subsets in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(9):1016 －20.

［12］Kanai T，Shiraishi H，Yamagata T，et al.Th2 cells predominate in idiopathic steroid-sensitive nephrotic syndrome［J］.Clin Exp Nephrol，2010，14(6):578 －83.

［13］Hwang E S，Szabo S J，Schwartzberg P L，et al.T helper cell fate specified by kinase mediated interaction of T-bet with GATA-3［J］.Science，2005，307(5708):430 －3.

［14］Lasfar A，Cohen-Solal K A.Resistance to transforming growth factor β-mediated tumor suppression in melanoma:are multiple mechanisms in place［J］?.Carcinogenesis，2010，31(10):1710－7.

［15］Carrier Y，Yuan J，Kuchroo V K，et al.Th3 cells in peripheral tolerance.II.TGF-beta-transgenic Th3 cells rescue IL-2-deficient mice from autoimmunity［J］.J Immunol，2007，178(1):172 －8.

［16］Cuadrado A，Nebreda A R.Mechanisms and functions of p38 MAPK signalling［J］.Biochem J，2010，429(3):403 － 17.