肝動脈栓塞化療聯合恩度治療對兔VX2肝移植瘤生長及血管生成的影響

謝 斌，位曉丹，高志芹，吳 潼，石劍飛，蹇兆成，孫業全，王 濱

(濰坊醫學院1.細胞生物學教研室，2.附屬醫院影像中心，山東濰坊 261053)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種富血供的惡性實體瘤，嚴重威脅人們的健康。肝動脈栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)自1976年Goldstain等首先報道后得到廣泛應用，現已成為治療手術不能切除肝癌的首選療法［1-2］，但其5年的生存率低于10%。通過研究發現［3］，TACE治療后由于殘癌組織內缺氧，致VEGF等表達升高，促進新生血管的生成，為腫瘤生長提供營養及氧氣，促進其增殖、轉移。多數學者認為抗血管生成治療對腫瘤只能抑制其生長，并不能治愈，需其他療法的聯合應用。因此若將TACE與抗血管生成聯合應用，在阻斷肝動脈供血的同時抑制血管生成，將為肝癌治療提供一條新途徑。有研究表明恩度肝動脈灌注聯合介入栓塞化療治療肝癌，近期效果滿意［4］。但目前相關報道較少，療效尚需大量的實驗證實。故本實驗將TACE和恩度聯合應用治療兔VX2肝移植瘤模型，通過評價相關性指標，探討其治療機制，為其聯合應用可行性提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康新西蘭純種大白兔24只，♂性，3 月齡，(2.32 ±0.47)kg，由山東省農科院提供(許可證號:sxk-魯-2004-0013);瘤兔1只由中國協和醫科大學基礎醫學院提供(許可證號:scxk-京-2005-0002)。

1.2實驗試劑阿霉素購自浙江海正公司;超液化碘油購自法國Guerbet公司;恩度購于煙臺麥得津;鼠抗人CD31單抗、Envision檢測試劑盒購于丹麥Dako公司、鼠抗 VEGF 單抗、PCNA、β-actin、PV-9000通用試劑盒等均購自北京中杉金橋;NC膜、BCA蛋白測定試劑盒、ECL顯色試劑盒購自碧云天。

1.3試驗方法

1.3.1建立模型、實驗分組和藥物干預參照文獻報道方法并加以改進建立兔VX2肝移植瘤模型［5］，用二維超聲檢測瘤體至0.5～1.5 cm3時(接種 d 13)，將24只瘤兔隨機分為TACE組(經微導管肝動脈灌注充分混勻的0.2 ml·kg-1超液態碘油與2 mg·kg-1阿霉素混合液)、抗血管生成組(經微導管肝動脈灌注 2 ml·kg-1恩度、0.2 ml·kg-1超液態碘油與2 mg·kg-1阿霉素的混合液)和對照組(經微導管肝動脈灌注同等劑量的生理鹽水10 ml·kg-1)，每組8只，術后3 d，實驗兔肌肉注射青霉素40萬單位，連用4 d，預防感染。

Tab 1 Tumor volume in different phases of each group(±s，n=8)

Tab 1 Tumor volume in different phases of each group(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs control group

Group Tumor volum/cm3 Preoperative 7 d after operation 14 d after operation VGR/%7 d after operation 14 d after operation TACE 1.245 ±0.411 3.172 ±2.277 9.871 ±4.470* 203.9 ±255.8 741.9 ±390.3*Anti-angiogenesis 1.193 ±0.324 3.082 ±1.139 8.800 ±5.577* 152.1 ±27.1* 545.3 ±274.9*Control 1.147 ±0.564 4.439 ±2.956 15.873 ±3.321 249.4 ±86.4 1501.3 ±533.4

1.3.2影像學檢查用超聲實時監測腫瘤大小、腫瘤內部及周邊的回聲、有無壞死等。測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積V=0.5×a×b2及體積生長率VGR(%)=(V2-V1)/V1。

1.3.3標本制備及免疫組化檢測TACE術后14 d，空氣栓塞處死全部實驗動物，部分新鮮腫瘤組織(主要采用邊緣組織)用Western blot法檢測VEGF的表達。剩下組織4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，抗CD31單抗(工作濃度1∶50)按Envision法免疫組化檢測試劑盒說明書步驟進行，每批染色均設立陽性及陰性對照，試劑盒中已知陽性表達組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照;抗PCNA單抗(工作濃度1∶50)按通用型二步法試劑盒說明書步驟進行。MVD計數參照Weidner［6］方法進行，先在40倍顯微鏡下掃視整個切片，尋找血管密度區，即“熱點”，再在200倍鏡下計數染成棕黃色的血管數結果，用5個200倍視野下血管數目的平均數表示。PCNA陽性細胞染色為胞核內出現棕黃色顆粒，在400倍視野下隨機選取5個視野的200個細胞，按公式計算PCNA陽性細胞增殖指數(PI)=PCNA陽性細胞數/腫瘤細胞數。1.3.4Western blot檢測取50 mg組織，加蛋白裂解液，用BCA法進行蛋白定量，煮沸變性。10%的SDS-PAGE后轉膜，30 mA恒流、4℃轉移過夜。5%BSA中37℃封閉1 h，加VEGF抗體，β-actin抗體(1∶200)，4℃孵育過夜。HRP標記的二抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育1 h。應用ECL顯影、Quanity One軟件分析，計算各樣品VEGF蛋白的相對表達量。

1.3.5統計學處理所得數據均經SPSS13.0統計軟件處理，劑量資料用±s表示，包括t檢驗、方差分析、Pearson直線相關性分析。

2 結果

2.1超聲檢測結果接種2周后，全部實驗兔在超聲下均于肝左葉檢測到孤立結節影。治療后7 d，抗血管生成組腫瘤體積生長率與對照組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。治療后14 d，TACE組和抗血管生成組腫瘤體積和腫瘤體積生長率均明顯小于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見Tab 1。

2.2兔VX2肝移植瘤模型肝癌組織形態學觀察肉眼觀:標本為類圓形腫塊，切面灰白色、質韌，部分可見小片狀液化性壞死。見Fig 1。

Fig 1 Pathological morphology in-situ observation of rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor

鏡下觀:肝實質細胞部分呈多角形或圓形，有明顯的異型性。胞核大深染，核分裂象多見，核質比增大。異型性細胞呈浸潤性生長，與周圍肝實質無明顯分界，其間可見部分異性細胞排列成巢狀，血竇消失。肝組織間質內可見部分血管內皮增生，結締組織減少。由此可見造模成功(Fig 2)。

Fig 2 PCNA expressions of rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor after treatment and HE staining

Fig 3 CD31 expressions in rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor tissue(×200).

2.3免疫組織化學檢測結果免疫組化結果顯示，腫瘤微血管強陽性區域主要分布在腫瘤壞死區殘存組織及周邊(Fig 3)。抗血管生成組MVD值明顯低于其余兩組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見Tab 2。其余兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。PCNA主要為細胞核陽性定位呈顆粒型，染色呈現棕黃色，見Fig 1，抗血管生成組PI最低，與其余兩組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)，見Tab 2。

2.4Western blot檢測采用Western blot檢測結果顯示，TACE組VEGF蛋白的相對量最高，與另兩組相比差異均具統計學意義(P＜0.05)，抗血管生成組與對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)，見 Fig 4，Tab 2。

Fig 4 Expression of VEGF，β-actin in rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor tissue.

Tab 2 Expression of PCNA，CD31 and VEGF protein(±s，n=8)

Tab 2 Expression of PCNA，CD31 and VEGF protein(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs control group，△P ＜0.05 vs TACE group

Group PI/% MVD VEGF TACE 85.36 ±10.37 53.18 ±7.58 1.29 ±0.11*Anti-angiogenesis 62.83 ±7.82＊△ 31.55 ±6.71＊△ 0.60 ±0.05＊△Control 82.67 ±11.25 56.53 ±10.47 0.85 ±0.06

2.5 MVD、VEGF和VGR之間的相關性分析相關性分析結果顯示，3個實驗組中 MVD計數與VEGF表達之間均呈正相關性(r=0.933，P＜0.05);VEGF表達與VGR的分布之間也呈正相關性(r=0.563，P＜0.05)。

3 討論

VEGF的表達是促進腫瘤生長與轉移的主要機制之一。許多研究［7-8］表明，經導管動脈內栓塞后，VEGF表達上調，通過旁/自分泌作用機制，促進內皮細胞增殖、誘導血管新生并直接刺激腫瘤細胞生長［9］。我們通過前期實驗［10］也得到類似的結果:TACE栓塞后促進了VEGFmRNA的轉錄水平，進而促進了新生血管的形成。如何限制TACE術后殘癌細胞VEGF的表達，進而抑制腫瘤血管生成已成為關鍵性問題。

MVD是腫瘤血管生成的金評價指標，1990年Weidner采用內皮細胞表面標記物顯示乳腺癌新生血管，發現MVD與腫瘤侵襲性、淋巴結轉移、患者預后是相關的。CD31分子在人體實體腫瘤中主要表達于一些脈管及相關來源的腫瘤，如組織細胞惡性腫瘤、上皮樣的血管內皮瘤及肉瘤等，參與腫瘤細胞與血管內皮之間黏附過程。本實驗利用MVD作為抑制血管生成療效的檢測指標發現，抗血管生成組MVD較其它兩組明顯降低。而單純TACE組MVD高于抗血管生成組，甚至稍高于對照組，表明TACE阻斷腫瘤血供，促進腫瘤細胞變性壞死的同時，促使腫瘤復發轉移。病理研究認為，腫瘤的復發轉移等惡性行為隨著MVD的增加而增加。抗血管生成組MVD及VEGF表達較單純TACE與對照組明顯減低。這充分說明了TACE聯合抗血管生成治療的必要性。我們通過相關性分析發現，3個實驗組中MVD計數與VEGF表達之間均呈密切的正相關性趨勢，許多研究［11-12］也得到一致結果。說明將VEGF表達與MVD計數相結合對腫瘤復發、轉移及預后判斷更有意義。

細胞增殖和凋亡平衡的失調對細胞癌變的引發、癌前細胞和癌細胞的生存及生長起著極其重要的作用，并對評估腫瘤預后有一定意義［13］。PCNA能較好地反映腫瘤生物學行為，在腫瘤的良惡性的劃分及惡性程度的確定上有著廣泛的應用。PCNA的表達程度預示著細胞增殖活性及組織侵犯特性。本實驗中，抗血管生成組在TACE和恩度聯合應用治療后腫瘤細胞增殖活性受抑制程度明顯高于其他兩組。

綜上所述:TACE和恩度聯合使用在下調VEGF的表達，降低MVD以及抑制細胞增殖方面都具有單純TACE所不具備的優勢。但目前對TACE和恩度聯合使用在肝癌治療方面的報道較少，且治療機制尚未探明，仍需大量工作為其臨床應用可行性提供依據。

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