海參巖藻聚糖硫酸酯對小鼠急性酒精中毒防治作用的研究

滕來賓，王靜鳳，楊延存，李 冰，張 珣，薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003)

急性酒精中毒又稱醉酒，指短時間內飲入過量的酒精或酒精飲料后所引起的中樞神經系統興奮及隨后的抑制狀態。在美國，過量飲酒引起的肝臟疾病已成為男性的第4大主要死亡原因［1］。因此，尋找一種有效的解酒護肝食品或藥品是很有必要的。海參多糖是海參體壁中重要的活性成分，主要可分為海參巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan isolated from sea cucumber，SC-FUC)和海參硫酸軟骨素兩種組分。其中，SC-FUC是一類主要由巖藻糖組成的硫酸多糖，屬于巖藻聚糖硫酸酯類化合物，主要存在于褐藻門植物和棘皮動物體內。目前，有關褐藻巖藻聚糖硫酸酯的生物活性有較多報道，例如，抗氧化、抗腫瘤、降脂、降血壓、保護肝臟、增強免疫力等［2-6］。與褐藻巖藻聚糖硫酸酯相比，SC-FUC化學結構差異較大［7-8］，其活性僅在抗凝血、增強免疫力等方面有少量報道［9-10］。海地瓜(Acaudina molpadioides)為芋海參科棘皮動物，俗稱海茄子，盛產于亞熱帶沙質海區，在我國的海南、廣東、福建、浙江沿海等地資源量豐富，市場價格低廉［11］。本實驗室前期研究表明，海地瓜體壁富含SC-FUC(約占干重4%)，但目前對海地瓜的開發利用仍處初級加工水平。本實驗利用從海地瓜中制備的SC-FUC研究了其對過量飲酒小鼠的防醉和保護作用，以期找到一種有效的解酒護肝食品或藥品，以及為低值海參的高值化利用提供理論依據。

1 材料

1.1海地瓜海地瓜(A.Molpadioides)，購于山東省青島市南山水產品市場。

1.2實驗動物健康ICR小鼠，♂，體質量18～22 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為SCXK(京)2006-2009。

1.3藥品與試劑白酒(紅星二鍋頭，乙醇含量56%)為北京紅星股份有限公司產品，復方益肝靈片為江蘇中興藥業有限公司產品，ALT、AST、ADH、MDA、GSH-Px、CAT試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品，ALD試劑盒為長春匯力生物技術有限公司產品，其它試劑為國產分析純。

1.4儀器GL-20M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司產品;數顯恒溫水浴鍋，金壇市雙捷實驗儀器廠產品;CA-958系列半自動生化分析儀，長春光機醫療儀器有限公司產品;WFJ 2000型可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司產品;Model 680型酶標儀，Bio RAD產品;MP200型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品。

2 方法

2.1海參巖藻聚糖硫酸酯制備海地瓜干品經粉碎、丙酮浸泡脫脂后，室溫晾干。將海參干粉與木瓜蛋白酶按10∶1比例混合酶解，離心(4 000 r·min-1，15 min，20 ℃)，向上清液中加入氯化十六烷基吡啶沉淀多糖。將沉淀溶解于3 mol·L-1NaCl∶乙醇(100∶15，V/V)溶液，用體積分數為95%的乙醇沉淀過夜。沉淀分別經體積分數為80%和95%的乙醇洗滌、60℃干燥、蒸餾水溶解、超濾脫鹽、濃縮、凍干，得海參粗多糖。將海參粗多糖按1∶30(W/V)溶于 25 mmol·L-1pH 6.3 磷酸緩沖溶液，采用Q sepharose fast flow陰離子交換柱，以2.0～2.5 mol·L-1NaCl溶液(25 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4，pH 6.3)梯度洗脫，流速為 5 ml·min-1。收集、凍干，得 SC-FUC［12-13］。采用 PMP 柱前衍生-HPLC法測得其單糖組成絕大部分為巖藻糖，采用離子色譜法測得其硫酸根含量為26.3%。

2.2動物分組和實驗健康♂ ICR小鼠50只，適應性喂養3 d后，按體重隨機分為5組，正常對照組(灌服等體積生理鹽水)、模型對照組(灌服等體積生理鹽水)、益肝靈陽性對照組(150 mg·kg-1·d-1)、SC-FUC 低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、SCFUC(100 mg·kg-1·d-1)高劑量組，每組10只。各組小鼠根據體質量按8 ml·kg-1預灌胃受試物3 d，于末次給藥后當晚禁食不禁水8 h，小鼠先灌胃上述劑量受試物，1 h后，藥物組和模型對照組小鼠根據體重15 ml·kg-1灌胃白酒，正常對照組灌胃同體積生理鹽水。觀察小鼠活動情況，記錄小鼠翻正反射消失和恢復的時間(即醉酒和醒酒時間)。以小鼠1 min內能否進行3次反正反射為醉酒標準［14］。小鼠灌胃白酒24 h后，摘眼球取血，常規分離血清，備用?？焖賱冸x肝臟，稱重，-80℃保存備用。

2.3血清ALT和AST活力測定參照試劑盒方法測定血清ALT和AST活力，結果以卡門氏單位表示。卡門氏單位表示定義:1 ml血清1 min內所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD+引起吸光度每下降0.001為一個單位。

2.4肝臟勻漿液的制備約取肝臟0.3 g，冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，將肝臟與冷生理鹽水1∶9混合勻漿，離心(8 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，取上清，-80℃保存待測。蛋白含量采用雙縮脲法測定。

2.5肝臟有關生化指標的測定肝組織 ADH、ALD、CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量均按試劑盒方法進行測定。

2.6統計學分析數據以±s表示，采用SPSS 11.0軟件進行 One Way ANOVA分析，同時進行LSD比較。

3 結果

3.1對小鼠醉酒和醒酒時間的影響由Tab 1可見，SC-FUC低、高劑量均能明顯推遲小鼠醉酒時間，SC-FUC低劑量組小鼠醒酒時間較模型對照組提前了19.08%，表明SC-FUC能有效提高小鼠對酒精的耐受能力。

Tab 1 Effects of SC-FUC on the time of ebriety and sobriety of mice(±s，n=10)

Tab 1 Effects of SC-FUC on the time of ebriety and sobriety of mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Time of ebriety/min Time of sobriety/min Model control 5.78 ±1.03 450.00 ±12.06 Positive control 7.13 ±2.67 396.57 ±86.46 SC-FUC low dose 7.86 ±1.64* 364.14 ±103.19 SC-FUC high dose 8.88 ±2.32＊＊418.50 ±43.87

3.2對小鼠血清ALT和AST活力的影響AST和ALT主要分布在肝臟和心肌中，其在血液中活力的高低反映了肝臟的受損傷程度。與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清ALT和AST活力分別提高了48.1%和65.3%(P＜0.05)。灌胃 SC-FUC 各劑量組均能明顯降低小鼠血清ALT和AST的活力(P＜0.01)，分別較模型對照組小鼠平均降低了37.3%和47.3%，表明SC-FUC能明顯拮抗酒精對肝臟的損傷，結果見Tab 2。

3.3對小鼠肝臟ADH和ALD活力的影響ADH和ALD是機體乙醇代謝關鍵酶，乙醇經ADH催化氧化成乙醛，乙醛再經過ALD催化氧化成乙酸，后者以乙酰CoA的形式進入三羧酸循環，最后氧化成CO2和H2O排出體外［15］。由Tab 2可見，模型對照組小鼠肝臟ADH活力較正常組明顯降低，與正常對照組相比，SC-FUC低劑量組小鼠肝臟ADH和ALD活力較模型對照組均有明顯升高，分別升高了34.3%(P＜0.01)和45.2%(P＜0.01)。高劑量組的ADH和ALD活力較模型對照組差異沒有統計學意義，說明適量SC-FUC能明顯促進小鼠肝臟中乙醇的代謝。

3.4對小鼠抗氧化能力的影響由Tab 3可見，SC-FUC能提高小鼠肝臟 GSH-Px、CAT和 SOD活力，降低MDA含量。與模型對照組比較，藥物組小鼠的肝臟GSH-Px、CAT和SOD活力平均分別提高了34.4%、17.5%和18%。劑量組小鼠的 MDA含量較模型對照組平均降低34.25%，其中以低劑量組差異有顯著性。說明適量SC-FUC能有效提高小鼠肝臟的抗氧化能力。

Tab 2 Effects of SC-FUC on the activities of ALT and AST in mouse serum and ADH and ALD in mouse liver(±s，n=10)

Tab 2 Effects of SC-FUC on the activities of ALT and AST in mouse serum and ADH and ALD in mouse liver(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group

Group ALT/U·L-1 AST/U·L-1 ADH/kU·g-1Pro ALD/kU·g-1Pro Normal control 28.71 ±4.02 23.33 ±4.16 4.38 ±0.34 2.79 ±0.21 Model control 42.53 ±12.48# 38.57 ±11.99## 3.09 ±0.39# 4.84 ±0.74#Positive control 25.13 ±5.54＊＊ 23.30 ±4.86＊＊ 4.54 ±1.00＊＊ 6.25 ±1.18 SC-FUC low dose 27.42 ±9.31＊＊ 21.96 ±6.66＊＊ 4.15 ±0.70＊＊ 7.03 ±1.83*SC-FUC high dose 25.92 ±6.82＊＊ 18.70 ±3.02＊＊3.49 ±0.84 5.67 ±1.04

Tab 3 Effect of SC-FUC on the activities of GSH-Px，CAT，SOD and the content of MDA in mouse liver(±s，n=10)

Tab 3 Effect of SC-FUC on the activities of GSH-Px，CAT，SOD and the content of MDA in mouse liver(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group

Group GSH-Px/kU·g-1Pro CAT/kU·g-1Pro MDA/mmol·g-1Pro SOD/kU·g-1Pro Normal control 524.49 ±61.99 11.70 ±1.43 1.42±0.20 177.69 ±29.28 Model control 420.49 ±73.57# 10.04 ±0.45 3.99 ±1.40## 191.40 ±41.41 Positive control 509.21 ±53.66* 12.54 ±1.33* 2.59 ±0.72* 201.64 ±31.12 SC-FUC low dose 601.19 ±43.98＊＊ 12.83 ±1.56* 2.05 ±0.36＊＊ 233.73 ±10.43 SC-FUC high dose 528.80 ±11.62*10.76 ±2.24 3.2 ±0.93 217.96 ±24.59

4 討論

目前，研究解酒藥物是以降低飲酒者血中乙醇及其代謝產物的濃度，減輕各器官受到的損傷為核心。乙醇被機體吸收后，在ADH的催化下可被脫氫氧化為乙醛。乙醛具有很強的毒性，是導致肝損傷的直接作用者［16］，它能使肝細胞內線粒體受損，在黃嘌呤氧化酶作用下形成超氧化物，引起脂質過氧化，導致肝細胞損傷。另外，乙醛還與蛋白質結合形成乙醛復合體，導致蛋白質功能紊亂，導致肝細胞再次受損［17］。乙醛在肝臟內經ALD繼續被氧化成乙酸，最后以乙酰CoA的形式進入三羧酸循環。乙醇代謝的整個過程中有大量活性氧生成，導致肝細胞脂質過氧化反應引起肝細胞損傷［18］。據乙醇在機體內的代謝特點，解酒藥物主要從兩方面發揮作用:其一、抑制酒精的胃腸吸收，加強乙醇在胃腸道的首過效應;其二、藥物直接作用于肝代謝酶系，加速乙醇及其代謝產物的清除速率，減輕其對組織細胞的損害［19］。實驗結果顯示，SC-FUC能夠有效推遲小鼠醉酒時間，縮短醒酒時間，明顯提高小鼠肝臟ADH和ALD活力，提示SC-FUC能明顯促進乙醇在小鼠體內的代謝，具有明顯的防醉和解酒作用。

肝臟是機體含酶最豐富的臟器，當肝臟受到實質性損害時，會引起血清中ALT和AST活性升高。實驗結果顯示，SC-FUC能明顯降低血清中ALT和AST活性，提示SC-FUC具有明顯地保肝護肝作用。

SOD、CAT和GSH-Px均為機體重要的抗氧化酶。其中，SOD專一性的清除超氧陰離子自由基，有明顯的抗脂質過氧化作用。CAT能阻止H2O2轉變為·OH，并使之分解為H2O和O2。GSH-Px也能催化H2O2的分解，降低機體內·OH的水平，從而保護生物膜［20］。大量研究表明，褐藻類巖藻聚糖硫酸酯有明顯的抗氧化作用。例如，半葉馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯［21］、海帶巖藻聚糖硫酸酯［22］對自由基具有較高的清除能力。任丹丹等［23］研究發現海帶巖藻聚糖硫酸酯對四氯化碳引起的肝損傷小鼠有一定的保護作用。本實驗結果顯示，SC-FUC能明顯提高小鼠肝臟CAT和GSH-Px活力，降低MDA含量，這與褐藻巖藻聚糖硫酸酯的文獻報道相似。提示SC-FUC可促進乙醇代謝過程中生成大量活性氧的清除，降低肝細胞的脂質過氧化程度，起到保護肝臟的作用。

綜上所述，SC-FUC具有明顯的防醉酒、促進醒酒和保護肝臟作用，其作用機制與提高肝臟ADH和ALD活力，加速乙醇的代謝過程，同時提高肝臟抗氧化能力，降低活性氧自由基對肝細胞膜上脂質和蛋白的損傷，維持細胞膜結構與功能完整性有關。SC-FUC是否能夠抑制胃腸對酒精的吸收，尚需進一步研究。本實驗為SC-FUC作為一種功效因子在功能食品或藥品方面的深度開發，以及低值海參的高值化加工和利用提供了理論依據。

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