人參皂苷對醛糖還原酶的抑制作用

孟凡麗，蘇曉田，劉發貴，鄭毅男，侯立娜

(1.吉林農業大學中藥材學院，吉林長春 130021;2.遼寧農業職業技術學院，遼寧 營口 115009)

糖尿病為一種常見病、多發病，目前我國糖尿病患者已超過4 000萬人。由糖尿病并發癥引起的死亡人數在發達國家繼心腦血管疾病、癌癥之后列第3位。糖尿病可引發白內障、視網膜病變、神經病變、腎功能不全及腎小球基底膜增厚等糖尿病慢性并發癥。大量研究證實［1－2］，糖尿病并發癥與糖代謝的多元醇通路有關，而醛糖還原酶(aldose reductase，AR)是該通路的關鍵限速酶。由糖代謝的多元醇通路激活機制發現，醛糖還原酶抑制劑(aldose reduetase inhibitors，ARIs)能有效抑制AR的活性，預防和延遲糖尿病并發癥的發生和發展。人參皂苷是傳統中藥人參的主要活性成分，具有抗心肌缺血、抗腦缺氧缺血、抗衰老、抗氧化、抗疲勞、腎功能保護、降血脂和降血糖等功效［3－5］，但對于抑制糖尿病并發癥尚未見報道，本研究測定人參皂苷對AR的抑制功效，以期發現人參皂苷在治療糖尿病并發癥方面潛在的價值。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器人參皂苷 Re、Rd、Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc，購自吉林大學化學學院天然藥物化學研究室;新鮮牛眼睛由遼寧省營口市北方精制牛肉加工廠提供;DL-甘油醛和NADPH(還原型)分別購自美國Sigma公司和意大利Roth公司;牛血清白蛋白，購自北京奧博星生物技術責任有限公司;考馬斯亮藍，購自天津市瑞金特色化學品有限公司;依帕司他(Epalrestat，EPS)，揚子江制藥公司。

760CRT雙光束紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;GL-12B型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2方法

1.2.1牛眼晶狀體中AR的分離參照Federico報道的方法［6］，稍加改良，所有步驟均在4℃以下進行。稱取300g牛晶狀體，加入3體積磷酸鹽緩沖液中用組織搗碎機搗碎;12 000 r·min－1離心20 min，取上清液緩慢加入硫酸銨至0.40飽和度，間歇攪拌1 h;再 10 000 r·min－1離心 15 min，取上清液加入硫酸銨至0.50飽和度，間歇攪拌1 h;10 000 r·min－1離心15 min，取上清液加入硫酸銨至0.75飽和度，間歇攪拌 3 h，10 000 r·min－1離心 15 min，取沉淀用少量的0.05 mol·L－1氯化鈉溶液溶解，透析12 h，即得AR粗提物，分裝，－70℃冷凍保存備用。以牛血清白蛋白為對照品，采用Brad-ford染色法［7］測定AR粗提物中蛋白質的含量。

Tab 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR at 100 mg·L-1concentration(±s，n=15)

Tab 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR at 100 mg·L-1concentration(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Rg2 Rg1 Rb1 Rb2 Rb3 Rc Rd Re EPS(control)Inhibitory rate 1.573 0.901 0.034 －0.067 －0.253 －0.094 0.782 －0.415 0.453±0.176＊＊ ±0.038＊＊ ±0.009＊＊ ±0.011 ±0.026 ±0.010 ±0.056＊＊ ±0.047 ±0.029

1.2.2人參皂苷單體對AR抑制作用的測定參照Halder等［8］的方法，測定溫度為25℃，酶反應總體積為 6 ml，包括:163 mg·L－1酶液 0.8 ml，0.8 mmol·L－1NADPH 1.0 ml，40 mmol·L－1DL-甘油醛 1.2 ml，2.0 ml的0.1 mol·L－1pH 6.2 磷酸鉀緩沖液以及不同濃度種類的人參皂苷溶液。加入底物DL－甘油醛開始反應，以340 nm處每分鐘NADPH吸光值的下降來表示AR的活性，每30 s測定1次，反應時間至少記錄3 min。陽性對照為100 mg·L－1EPS，空白對照為重蒸水。樣品對AR的抑制率按下面公式進行計算:

待測樣品對AR抑制率/%=［1－(A2－A0)/(A1－A0)］×100%

式中A0:未加醛糖還原酶、底物和樣品，即每分鐘NADPH自然吸光值的下降。

A1:未加樣品，加入醛糖還原酶、底物，每分鐘NADPH吸光值的下降。

A2:加醛糖還原酶、底物和樣品，每分鐘NADPH吸光值的下降。

以樣品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制曲線，依據動力學曲線計算其半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3人參皂苷單體對AR抑制類型的測定選取抑制活性較高的提取物，測定其對AR的抑制類型。反應溫度為25℃，酶反應總體積3 ml，包括:163 mg·L－1酶液 0.4 ml，0.8 mmol·L－1NADPH 0.5 ml，100 mg·L－1人參皂苷 Rb1、Rd、Rg1 和 Rg2 0.5、1.0 ml，然后分別加入 40 mmol·L－1DL-甘油醛 0.75、0.375、0.25、0.188、0.15 ml啟動反應，記錄每分鐘NADPH吸光值的下降。采用雙倒數作圖法，確定抑制劑的抑制類型，根據米氏方程計算動力學常數。

1.2.4統計學處理采用SPSS 11.0統計軟件進行分析，實驗數據表示為±s。

2 結果

2.1牛眼睛醛糖還原酶含量測定結果牛血清蛋白標準曲線:Y=0.1059X+0.1593，相關系數:0.9991。經定量分析測得牛眼睛 AR濃度為361.463 mg·L－1。

2.2人參皂苷對醛糖還原酶抑制作用從Tab 1可以看出在100 mg·L－1濃度時，人參皂苷 Rb2、Rb3、Rc和Re對醛糖還原酶抑制率為負值，說明他們對醛糖還原酶沒有抑制作用;而人參皂苷Rg1、Rg2、Rd和Rb1對醛糖還原酶抑制率為正值，說明他們對醛糖還原酶有抑制作用。另外從圖1看出人參皂苷Rg1、Rg2、Rd和Rb1對AR的抑制作用隨濃度的增加逐漸增強，與其濃度存在明顯的劑量－效應關系。

Tab 2是將Fig 1數據依據動力學曲線計算半數抑制濃度。結合Fig 1和Tab 2可知人參皂苷對AR的抑制，半數抑制濃度超過EPS的是人參皂苷Rb1，低于 EPS的是 Rg1、Rg2、Rd。說明人參皂苷 Rd、Rg1和Rg2對AR的抑制作用強于EPS，而Rb1的抑制作用較弱。另外根據半數抑制濃度大小，可知人參皂苷對AR抑制從高到低順序依次是人參皂苷Rg2、Rg1、Rd 和 Rb1。

Fig 1 Inhibitory effect of ginsenoside on AR

Tab 2 IC50values of ginsenoside on AR

2.3人參皂苷對AR的抑制類型選取對AR抑制活性超過EPS的人參皂苷Rd、Rg1和Rg2，采用雙倒數作圖法，測定其濃度分別為0.017和0.033 g·L－1時對AR的抑制類型，Fig 2可以看出，不同人參皂苷對AR的抑制作用隨著底物濃度的增大，其抑制作用隨之增強，為反競爭性抑制。

Fig 2 Inhibition type of ginsenoside on AR

3 討論

治療糖尿病并發癥的藥物中，目前市場銷售的都是合成類AR抑制劑。合成類AR抑制劑的最大問題就是毒性反應。有研究資料報道［9－11］中草藥提取物石榴皮多酚、丹參酮類化合物、黃芩苷等對AR有抑制作用，他們優點是毒性作用較低，但通常由于其水溶性較差，且相對合成類藥物而言對AR的抑制活性較弱，因此臨床使用也受到某種程度的限制。本研究的結果表明:人參皂苷Rb1、Rd、Rg1和Rg2對AR具有抑制作用，而人參皂苷Rb2、Rb3、Rc和Re的抑制作用不明顯。半數抑制濃度的進一步分析表明，人參皂苷Rd、Rg1和Rg2對AR的抑制作用強于依帕司他，而Rb1的抑制作用較弱。說明人參皂苷Rg2、Rg1、Rd對AR具有較強的抑制作用，在糖尿病并發癥治療方面具有潛在的應用價值，而且其在治療糖尿病方面具有毒性作用低的優點。

本研究發現對AR有抑制活性人參皂苷對AR抑制從高到低順序依次是人參皂苷Rg2、Rg1、Rd和Rb1，這種差異可能與其結構不同有關。下面做一下簡單分析:首先分析皂苷的種類，人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd苷元是20S－原人參二醇，人參皂苷Re、Rg1和Rg2苷元是20S－原人參三醇，從對AR抑制結果看出對AR抑制與苷元的種類無關;其次分析皂苷糖鏈的的種類，雙糖鏈是人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re 和 Rg1，單糖鏈的是人參皂苷Rg2，試驗結果發現人參皂苷Rg2對AR抑制能力最強，說明單糖鏈皂苷對AR抑制能力強;接下來分析皂苷糖鏈上糖的種類，有兩種糖的皂苷是人參皂苷Rb2、Rb3、Rc、Re和 Rg2，有 1 種糖且是葡萄糖的是人參皂苷Rg1、Rd和Rb1，這3種皂苷對AR都有抑制作用，說明對AR的抑制與皂苷上糖鏈是否是葡萄糖有關。最后分析糖鏈葡萄糖的數量，人參皂苷Rg1糖鏈葡萄糖數量是2個，人參皂苷Rd糖鏈葡萄糖數量是3個，人參皂苷Rb1糖鏈葡萄糖數量是4個，本試驗測定的結果發現這3種人參皂苷對AR抑制從高到底順序依次是人參皂苷 Rg1、Rd和Rb1，說明人參皂苷糖鏈上葡萄糖的數量越多，對AR的抑制能力越差，故對AR的抑制與皂苷上葡萄糖的數量有關。

本研究發現人參皂苷Rg2、Rg1、Rd對AR的抑制作用均為反競爭性抑制，而EPS是一種可逆性非競爭型的醛糖還原酶抑制劑［12］。正常狀態時體內葡萄糖主要經糖酵解通路后進入有氧或無氧途徑進一步代謝，多元醇通路只是起到補充作用，在糖尿病高血糖狀態時，糖酵解達到極限，多元醇通路的代謝明顯加強，在正常情況下，細胞內的葡萄糖僅約5%進入多元醇通路，糖尿病狀態下，該通路異常激活，約30%的葡萄糖進入此通路，多元醇通路的異常激活是糖尿病慢性并發癥的重要發病機制之一。EPS作為ARI，可以特異性地阻斷多元醇通路，有效干預糖尿病并發癥的發生。而人參皂苷Rg2、Rg1、Rd抑制糖尿病并發癥的作用機制是否跟EPS一樣，其它人參皂苷是否具有抑制醛糖還原酶活性有待進一步研究。

［1］Costantino L，Rastelli G，Vianello P.Diabetes complication and their potential prevention:aldose reductase inhibition and other approachs［J］.Med Res Review，1999，19:3 － 24.

［2］Kawanishi K，Ueda H，Moriyasu M.Aldose reductase inhibitors from the nature［J］.Curr Med Chem，2003，10(15):1353 －74.

［3］黃海英.人參皂甙藥理作用［J］.世界最新醫學信息文摘，2003，2(1):534 －5.

［3］Huang H Y.Pharmacological effect of ginsenoside［J］.Dig World Latest Med Inform，2003，2(1):534 －5.

［4］Attele A S，Zhou Y P，Xie J T，et al.Antidiabetic effects of Panax ginseng berry extract and the identification of an effective component［J］.Diabetes，2002，51(6):1851 － 8.

［5］Cho W C，Chung W S，Lee S K，et al.Ginsenoside Re of Panax ginseng possesses significant antioxidant and antihyperlipidemic efficacies in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2006，550(1 －3):173 －9.

［6］Federico D S，Giampaolo P，Concettina L M，et al.Spirohydantoin derivatives of thiopyrano［2，3 － b］pyridine-4(4H)-one as potentin vitroandin vivoaldose reductase inhibitors［J］.Bioorg Med Chem，2005，13(2):491－9.

［7］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Analyt Biochem，1976，72:248 －54.

［8］Halder H，Joshi S，Gupta S K.Lens aldose reductase inhiniting potential of some indigenous plants［J］.J Ethnopharm，2003，86(1):113－6.

［9］孫 慧，賈冬英，姚 開.石榴皮多酚提取物對醛糖還原酶的抑制作用［J］.天然產物研究與開發，2008，20:508－10，21.

［9］Sun h，Jia D Y，Yao K.Inhibitory effect of polyphenol extract from pomegranate peel on aldose reductase activity［J］.Nat Product Res Devel，2008，20:508 －10，21.

［10］杜志云，覃江克，喬 薇，等.丹參酮類化合物對醛糖還原酶抑制作用的研究［J］.中山大學學報，2007，46(3):59 －63.

［10］Du Z Y，Qin J K，Qiao W，et al.Inhibition activities of tanshinones on aldose reductase［J］.J Sun Yat-sen Univ，2007，46(3):59 －63.

［11］王秀軍，劉長山，李兆欣，等.黃芩苷對糖尿病大鼠組織醛糖還原酶活性及視網膜細胞凋亡的影響［J］.中國糖尿病雜志，2008，16(8):507 －8.

［11］Wang X J，Liu C S，Li Z X，et al.The effect of baicalin oil tissue aldose reductase activity and retinal apoptosis in diabetic rats［J］.Chin J Diabete，2008，16(8):507 －8.

［12］陳 亮，楊華章.依帕司他在糖尿病及其并發癥治療中的應用［J］.廣東醫學，2006，27(11):1757 －8.

［12］Chen L，Yang H Z.Epalrestat therapy application on diabetes mellitus and complications［J］.Guangdong Med J，2006，27(11):1757－8.